Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело.
8.8.L Выделение IgG, связанного с иммобилизованными антигенами.
1) Готовят плоский слой геля для изоэлектрического фокусирования из шариков сефадекса G-200 Superfine, предварительно набухших в соответствующем буфере и содержащих 1—5%-ный (об./об.) раствор амфолита (концентрация растворов амфолита, выпускаемых различными фирмами, может варьировать; надо следовать прилагаемым инструкциям).
2) В первую очередь ставят опыт, используя широкий набор амфолитов (pH 3—10).
3) Через слой пропускают электрический ток и проводят фокусирование при охлаждении (при 2000 В/ч).
4) После установления градиента pH прекращают подачу электрического тока, наносят аффинный гель в выемку с pH, отличающимся на 1—2 единицы от изоэлектрической точки белка (в случае IgG выбирают значения pH 5,5н-6,0 или 10).
5) Присоединяют источник тока и проводят электрофокусирование при напряжении, которое допускает система охлаждения.
6) Через 1 ч часть плоского слоя геля из сефадекса G-200 в области изоэлектрической точки IgG удаляют и анализируют его на антитела.
122
Глава 4
Фирма Pharmacia поставляет оборудование для этого эксперимента; перед работой следует ознакомиться с прилагаемыми инструкциями, а также с работой [45].
9. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦИЛИНДРИЧЕСКИХ ПЕРЕГОРОДОК В КРУПНОМАСШТАБНЫХ АФФИННЫХ КОЛОНКАХ
9.1. Введение
Аффинная хроматография нашла широкое применение для очистки биологических продуктов в небольшом масштабе. Для промышленного применения обычно необходимы хроматогра-фические колонки большого диаметра. Однако в крупномасштабных колонках уплотнение слоя адсорбента ограничивает максимальную поверхностную скорость потока жидкости и может быть причиной непостоянства этой скорости. В работе [46] предложено размещать в колонке с внутренним диаметром 10,0 см параллельные стенкам колонки (коаксиальные) цилиндрические перегородки; при этом изучено влияние наличия таких перегородок на максимальную поверхностную скорость и профили проскока и элюирования. В следующем разделе кратка описаны соответствующие эксперименты.
9.Li. Сравнение эффективности хроматографических колонок с перегородками и без них.
1) Используя методы, описанные в гл. 1, готовят адсорбент путем иммобилизации ингибитора трипсина из соевых бобов на CNBr-активированной сефарозе 4В.
2) Для регулирования адсорбционной емкости слоя сорбента полученный адсорбент смешивают с сефарозой 4В в соотношении 7:93 (об./об.).
3) Работу проводят в двух полиакриловых колонках с внутренними диаметрами 1,44 и 10,0 см.
4) Для получения равномерного распределения потока жидкости сверху и снизу каждой колонки помещают пористые стеклянные фильтры.
5) Собирают один из двух типов коаксиальных перегородок — один, состоящий из трех коаксиальных цилиндров с внутренним диаметром 2,5, 5,0 и 7,5 см, и другой — из цилиндра с внутренним диаметром 5,0 см (все детали сделаны из нержавеющей стали толщиной 0,4 мм)—и вставляют в колонку с внутренним диаметром 10,0 см.
6) Упаковывают каждую колонку адсорбентом так, чтобы на единицу площади поперечного сечения колонки приходилось одинаковое количество адсорбента; изучают влияние диаметра колонки и наличия в нем перегородок. Для этого снимают следующие параметры:
Методики эксперимента
123
0,01 0,02 0,03
Поверхностная скорость жидкости,см/с
Рис. 12. Изменение перепада давления и высоты слоя сорбента при изменении поверхностной скорости жидкости для колонок с двумя разными диаметрами и различными перегородками. Особенности и диаметр колонки: 1— 1,44-см без перегородок; 2 — 10,0-см без перегородок; 3 —10,0-см с 5,0-см перегородкой; 4 — 10,0-см с 2,5-, 5,0-, 7,5-см перегородками [46J. (Воспроизведено с разрешения.)
Рис. 13. Кривые элюирования на колонках с перегородками и без них (высота слоя сорбента ~ 10 см, скорость жидкости 0,02см/с). Использованы колонки следующих диаметров: І —1,44-см без перегородок; 2 — 10-см с 2,5-, 5,0- и 7,5-см перегородками; 3—10-см без перегородок ?47]. (Воспроизведено с разрешения.)
0 10 20 30 Объем элюента, см^см2колонки
а) перепад давления в слое адсорбента;
б) профили проскока;
в) кривые элюирования.
7) Колонку уравновешивают буферным раствором (0,05 M трис-HCl, содержащий 0,02 M CaCl2, pH 8,2).
124
Глава 4
8) Раствор трипсина в том же буфере вводят в колонку с помощью перистальтического насоса.
9) Колонку промывают тем же буфером и элюируют трипсин раствором, содержащим 0,005 моль/л HCl и 0,5 моль/л NaCL
10) Измеряют поглощение элюата при 280 нм.
