Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
4) Низкомолекулярные вещества из реакционной смеси удаляют, пропуская реакционную смесь через колонку с сефадек-сом G-25 (30X2,5 см), предварительно уравновешенную 0,9% (масс/об.) раствором NaCl, при элюировании также раствором NaCl (того же состава).
5) Очищенный конъюгат подкисляют разбавленной HCI до pH 4,6 и оставляют на 4 дня при 4 0C
6) Образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования; отделенный осадок вновь суспендируют в небольшом объеме воды и переводят в раствор путем добавления необходимого количества твердого NaHCO3.
7) Раствор лиофилизируют.
7.2. Получение изохлорокарбонатактивированных матриц
1) Карбоксилированную матрицу сушат над P2O5.
2) 1 г высушенной матрицы помещают в сухую предварительно взвешенную ампулу.
3) Матрицу суспендируют в сухом диоксане (5 мл) и добавляют три-я-бутиламин (1 мл).
4) Реакционную смесь оставляют на 10 мин, затем матрицу промывают сухим диоксаном (10 мл).
5) Охлаждают до O0C, добавляют изобутилхлорокарбонат (2 мл) и оставляют на 30 мин, поддерживая температуру <10°С.
5-139
66
Глава 2
6) Матрицу быстро промывают сухим диоксаном (20 мл), водно-диоксановой смесью (1:1, 50 мл) и водой (50 мл).
7) Добавляют раствор присоединяемого аминосоединения (содержащего 50—200 мкмоль аминогрупп) в буфере [pH 8,0;, могут применяться фосфат — NaOH или боратный буферы (0,02-0,2 M)].
8) Для удаления несвязавшегося лиганда адсорбент промывают и определяют концентрацию лиганда либо по количеству несвязавшегося лиганда, либо по данным химического анализа матрицы.
8. ПЕРИОДАТНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Полисахаридные матрицы могут быть активированы окислением вицинальных диольных групп метапериодатом натрия NaIO4, который переводит указанные диольные группы Сахаров в альдегидные. В отличие от CNBr-активирования метод периодатного окисления более быстрый и удобный. Метаперио-дат натрия растворим в водной среде и поэтому может быть легко удален после реакции промыванием. Активированный гель может храниться при 4 °С в течение многих дней без заметной потери активности. Введенные таким образом в матрицу альдегидные группы реагируют с большинством первичных аминов при значениях pH 4-1-6 с образованием шиффовых оснований, которые далее могут быть стабилизированы восстановлением борогидридом NaBH4, или, что более предпочтительно, цианоборогидридом (NaBH3CN).
1) Гель смешивают с равным объемом 0,2 M NaIO4.
2) Помещают в плотно закрытый полиэтиленовый сосуд и осторожно встряхивают на механической качалке в течение 2 ч при комнатной температуре.
3) Периодатокисленную матрицу отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой на пористом стеклянном фильтре.
8.1. Получение аминогексил-агарозы
8.1.1. Методика А.
1) Окисленную периодатом агарозу (100 мл) добавляют к 2,0 M водному раствору гександиамина (100 мл) при pH 5 и осторожно встряхивают в течение 6—10 ч при 2O0C
2) Повышают pH до 9,0 путем добавления твердого Na2CO3, затем небольшими порциями вносят свежеприготовленный водный раствор NaBH4 (10 мл) при 40C за 12 ч при осторожном перемешивании.
3) Восстановленный гель промывают 1,0 M NaCl до отсутствия амина в фильтрате.
Методы активации
67
8.L2. Методика Б.
1) Смешивают равные объемы окисленной периодатом агарозы, предварительно промытой 0,5 M фосфатным буфером (pH 6,0), 25 мМ раствора аминсодержащего лиганда в 0,5 M фосфатном буфере (pH 6,0) и 0,5 мМ раствора NaBH3CN; реакционную смесь оставляют на 3 дня при комнатной температуре.
2) Гель промывают и восстанавливают оставшиеся альдегидные группы путем добавления равного объема 1,0 M NaBH4 в течение 15 ч при 4 °С.
3) Перед использованием гель тщательно промывают дистиллированной водой.
8.2. Периодатная активация целлюлозы
1) Используя мешалку роторного или переворачивающего (end-over-end) типа, целлюлозные шарики или волокнистую целлюлозу (10 г) перемешивают с 0,5 M метапериодатом натрия (1 л) при комнатной температуре в течение 2 ч; добавляют этиленгликоль (30 мл) и продолжают перемешивание еще 1 ч.
2) Целлюлозу отфильтровывают и промывают водой (1л).
3) Промытый гель суспендируют в равном объеме воды.
4) К суспензии добавляют ~30 ммоль адипоилдигидразида, растворенного в минимальном объеме воды, и доводят pH реакционной смеси до 5,0 с помощью HCl.
5) Перемешивание продолжают еще в течение 1 ч, после чего доводят pH до 9 твердым карбонатом натрия.
6) Добавляют борогидрид натрия (1 г), перемешивают и оставляют на 12 ч в открытой колбе при 4 °С (Осторожно! Выделяется газообразный водород!).
7) Целлюлозу отфильтровывают и промывают 0,1 M уксусной кислотой (200 мл), а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата.
8.3. Получение иммуноадсорбентов с очень низким неспецифическим связыванием с использованием окисленной периодатом поперечно-сшитой сефарозы
Э. Фишер (E. А. Fischer)
Неспецифическое связывание с матрицей часто является серьезной проблемой в иммуноадсорбции компонентов сыворотки не только из-за снижения степени очистки, но также ввиду уменьшения достигаемого выхода. Этот эффект особенно проявляется при использовании бромоцианактивированной агарозы. Определенные классы IgG жестко связываются с такими гелями. Это связывание не зависит от метода, примененного
