Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
в 4,6 2,9 6,0 е 5,7 5,05 6,4
2) Сефарозу прибавляют к ксилол-диоксановому раствору (1:1, масс./масс.) ФХП (4—5 г ФХП в 40 мл раствора), предварительно охлажденному до 0°С; прибавление сефарозы ведут с такой скоростью, чтобы температура не повышалась выше 40C Операция занимает ~25 мин.
3) Реакционную смесь оставляют еще на 15 мин при 00C,. а затем добавляют концентрированную уксусную кислоту (4,2 мл).
4) Отделяют ФХП-агарозу, как описано в методике А (разд. 5.1.1, п. 5).
Некоторые аналитические данные представлены в табл. 5.
5.1.3. Методика В.
1) Сефарозу 4В (~25 г, отфильтрованный гель) промывают раствором NaOH или Na2CO3 (250 мл) (табл. 6); жидкость удаляют отсасыванием на пористом стеклянном фильтре (водоструйный насос).
2) «Щелочной сефарозой» наполняют пластмассовый шприц, как описано в методике Б (разд. 5.1.2, п. 1).
3) Все количество щелочной сефарозы в одну порцию вводят в 40 мл ксилол-диоксанового (1:1, масс./масс.) раствора ФХП, предварительно охлажденного до —10°С. При этом температура может повыситься до +9 0C, но затем при хорошем охлаждении довольно быстро падает.
Методы активации
6!
4) Реакцию проводят в течение 15 мин при +30C, затем добавляют небольшой избыток уксусной кислоты (~4,2 мл).
5) Активированную ФХП-агарозу отделяют, как описано а методике А (разд. 5.1.1, п. 5).
5.2. Присоединение гексаметилендиамина к ФХП-агарозе
1) Отделяют жидкость от ФХП-активированной сефарозы 4В отсасыванием на пористом стеклянном фильтре (водоструйный насос), гель суспендируют в водном растворе гексаметилендиамина (ГМДА); суспензию медленно вращают в течение 15—20 ч при комнатной температуре.
Таблица 6. Типичные результаты нескольких элементных анализов ФХП-активированных агарозных шариков, полученных по методике В
Партия Раствор, используемый для Количество ФХП, вве- Содержание, %
получения «щелочной сефа- денного в
розц» реакцию, г N F Cl
Ж 3,00 M NaOH 1,07 0,8 0,6 1,0
3 0,27 M NaOH 1,07 1,7 1,3 1,9
и 0,Ю M NaOH 1,00 0,9 0,9 1,15
к 0,27 M Na2CO3 (pH 11,4) 1,03 0,6 0,5 0,55
л 1,32 M NaOH 5,06 4,2 4,0 4,7
2) Продукт отфильтровывают, тщательно промывают б иди-стиллированной водой, 0,05 M HCl (2 объема геля), бидистил-лированной водой, 0,1 M NaOH (5 объемов геля) и вновь би-дистиллированной водой до нейтральной реакции элюата. Качественный контроль на присутствие первичных аминогрупп можно провести с помощью нингидринового реагента.
3) Аликвоту ГМДА-сефарозы промывают метанолом, жидкость удаляют путем отсасывания и сушат гель в вакууме.
Содержание N, F и Cl определяется элементным анализом.
5.3. Присоединение анилина к ФХП-агарозе
1) Активируют сефарозу 4В (23 г, отфильтрованный гель) v как описано в разд. 5.1.1 (методика А).
2) Активированный продукт суспендируют в растворе, содержащем анилин (1,74 г), 0,07 M фосфатный буфер (pH 7,0; 25 мл) и диоксан (10 мл, не содержащий пероксидов).
3) Суспензию вращают в течение 26 ч при комнатной температуре.
4) Продукт отфильтровывают, промывают водно-диоксаио-вой смесью (2,5: 1) (об./об.) и водой.
62
Глава 2
5) Аликвоту промывают ацетоном, жидкость удаляют путем отсасывания и сушат в вакууме. Содержание N, F и Cl определяют элементным анализом.
6) Выделение продукта проводят, как описано для ГМДА-•агарозы (разд. 5.2, п. 3).
5.4. Присоединение имидазола к ФХП-агарозе
1) ФХП-сефарозу 4В (5 г, отфильтрованный гель) промывают 0,2 M боратным буфером (pH 9,0; 50 мл) и суспендируют в 0,5 M растворе имидазола (5 мл) в том же буфере; суспензию вращают в течение 17 ч при комнатной температуре.
2) Продукт отфильтровывают, промывают водой, ОД M HCl, водой, 0,1 M NaOH и бидистиллированной водой.
3) Аликвоту промывают метанолом, жидкость удаляют путем отсасывания и сушат в вакууме.
Содержание N, F и Cl определяют элементным анализом.
5.5. Присоединение этантиола к ФХП-агарозе
1) ФХП-агарозу 4В (2 г влажного геля) суспендируют в растворе, содержащем этантиол (1 мл), 0,2 M боратный буфер (pH 9,2; 5,2 мл) и этанол (7 мл).
2) Суспензию вращают в течение 21 ч при комнатной температуре.
3) Продукт отфильтровывают и тщательно промывают вод-но-этанольным (1:1, об./об.) раствором, этанолом и в заключение ацетоном.
5.6. Присоединение глицилглицина/я-аминобензамидина
к ФХП-агарозе (биоспецифический адсорбент для трипсина)
1) ФХП-сефарозу 4В (11 г отфильтрованного геля; партия к — см. табл. 6) суспендируют в растворе, содержащем глицил-глицин (0,74 г) в 5 мл буфера (pH 10,6—0,5 M Na2CO3/ /NaHCO3).
2) Суспензию вращают в течение 27 ч при комнатной температуре.
3) Продукт отфильтровывают, промывают бидистиллированной водой (250 мл).
4) Отфильтрованный гель суспендируют в растворе дихло-рогидрата п-аминобензамидина (1,25 г, 6 ммоль) в бидистиллированной воде.
5) Доводят pH суспензии до 5,0 и добавляют хлорогид-рат 1-(3-диметиламинопропил)3-этилкарбодиимида (1,15 г, в ммоль).
Методы активации
6) Реакцию проводят при pH 5,0 в течение 2 ч при комнатной температуре.
7) Продукт отфильтровывают, промывают бидистиллирован-ной водой, 0,5 M NaCl (100 мл) и вновь бидистиллированной водой (250 мл).
