Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
3) Добавляют в пробирку соответствующее количество силана (табл. 9).
4) Пробирку закрывают и встряхивают на водяной бане при 90±5 °С в течение 5 ч.
5) Силанизированный силикагель тщательно промывают на стеклянном фильтре со средним диаметром пор сначала водой, а затем водой с H2SO4 при pH 3,0 (на этой стадии силикагель содержит как эпоксидные, так и диольные группы).
6) Силикагель переносят в круглодонную колбу, содержащую H2SO4 (pH 3,0; ~50 мл/г силикагеля).
7) В колбу помещают также несколько крупных стеклянных шариков, присоединяют обратный холодильник и рубашку для нагревания и кипятят смесь в течение 1 ч для гидролиза оставшихся эпоксидных групп.
8) Диолсвязанный силикагель промывают водой, затем метанолом, сушат в течение ночи при температуре ~70°С и хранят в эксикаторе.
13.4. Обсуждение
Не следует использовать магнитную мешалку из-за возможного размалывания силикагеля, что неблагоприятно сказывается на эффективности хроматографии.
Для суспендирования силикагеля требуется не менее 4 мл буфера на 1 г силикагеля. Надо брать по крайней мере 4-кратное количество силана относительно теоретического (для образования монослоя силана). Необходимое количество силана можно рассчитать, используя данные фирмы-производителя по площади поверхности силикагеля (м2/г); теоретически для образования монослоя диола необходимо 2,3 мкмоль/м2 [40]; молекулярная масса силана равна 236,3 г/моль; плотность 1,070 г/мл. При концентрации силана менее 2% (об./об.) необходимо использовать больший избыток последнего.
В случае необходимости содержание диола на силикагеле может быть определено с использованием метода периодатного окисления [41].
13.5. Определение содержания диола в диолсвязанном силикагеле методом периодатного окисления
Содержание диольных групп можно определить в соответствии с реакциями, приведенными на рис. 13. Диол окисляют пе-риодной кислотой. Иод, образующийся после добавления иоди-
Получение матриц
45
да калия, титруется тиосульфатом. Необходимо также проведение холостого опыта, поскольку реакция KI как с HIO3, так и с избытком HIO4 приводит к образованию иода.
Приведенная модификация периодатного метода [41] удобна для определения диола при содержании <10 мкмоль. Метод может быть применен как для больших, так и для меньших концентраций диола при использовании пропорционально больших или меньших объемов всех реагентов.
RCHOH-CH2OH +HIO4 -> HCHO + HIO3 + H2O
H(O3 + 5KI+ 5H+ -> 3I2+ 5K++3H2O
HIO4+ 7KI+ 7H+ ->- 4I2+ 7K++ 4H2O
1, + 2Na2S2O3 -> 2NaI+ Na2S4O0
Рис. 13. Реакции, используемые для определения диольных групп в диолсвя-
занном силикагеле.
13.5.2. Методика. Навеску образца, содержащую 1—8 мкмоль зуют продажные реагенты. Раствор 80%-ной (об./об.) уксусной кислоты в воде можно хранить без ограничений во времени, но другие растворы используют свежеприготовленными: 10%-ный (масс/об.) KI (5,0 г KI в 50 мл воды); 0,02 M HIO4 [0,25 г HIO4 •2H2O в 50 мл 80%-ной (об./об.) уксусной кислоты] и 0,02 M тиосульфат натрия [навеска 4,9 г Na2S2O3-SH2O (M = = 248,18) или 3,1 г Na2S2O3 (Af= 158,11) +0,04 г Na2CO3; довести до метки до объема 1 л водой].
13.5.2. Методика. Навеску образца, содержащую 1—8 мкмоль диола, помещают в пробирку объемом 30 мл. Добавляют раствор HIO4 (0,5 мл).
2) Этот раствор обрабатывают ультразвуком в вакууме водоструйного насоса в течение 30 с для удаления воздуха из пор силикагеля.
3) Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая пробирку для взмучивания силикагеля.
4) Добавляют раствор KI (0,25 мл) и титруют тиосульфатом (из бюретки на 10 мл) до полного исчезновения желтой
Содержание диола (мкмоль) —
(объем титранта для холостого опыта—объем титранта для образца) X
1 л 1 моль диола 10е мкмоль
Хмолярность тиосульфатаX——-X—-;-X-
1000 мл 2 моль тиосульфата моль
Рис. 14. Расчет концентрации диольных групп. Концентрация диола в образце получается при делении количества (в мкмоль) диола на массу образца
(в граммах).
26
Глава 1
окраски. Перед концом титрования стенки пробирки смывают водой.
5) Проводят холостое титрование раствора, содержащего только растворы HIO4 и KI.
13.5.3. Расчет. Вначале определяют молярность раствора тиосульфата Mthio, затем рассчитывают содержание диольных групп (рис. 14).
13.5.4. Обсуждение. Для проведения анализа можно использовать продажный тиосульфат. Если желательна большая точность, раствор тиосульфата титруют иодом [41] или готовят раствор тиосульфата из фиксанала [42].
Объем титранта, пошедшего на титрование, должен составлять менее 2/3 объема холостого опыта; если соотношение этих объемов равно 3/4, то это означает, что вся HIO4 была израсходована.
Когда различие между объемом титранта для холостого раствора и образца небольшое, очень важно провести несколько повторных определений как холостого раствора, так и образца.
Литература
1. Nicolaisen F. M., Meyland Lt Schaumburg /С., Acta Chem, Scand., B34(2), 103 (1980).
2. Porath Biochimie, 55, 943 (1973).
3. Hjeden S., Biochim. Biophys. Acta, 79, 393 (1964).
