Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Внутренние поры этих оксирановых шариков доступны для белков с молекулярной массой < 150 000. Благодаря высокому содержанию эпоксидных групп шарики характеризуются хорошей емкостью. Показано, что 1 г сухих шариков связывает 140 мг альбумина.
3-130
34
Глава 1
ЮЛ. Реакции эупергита с белком
10JA. Общая методика.
1) Перед связыванием препараты белка, содержащие аммониевые соли, должны быть обессолены путем диализа или ультрафильтрации; в последнем случае они могут быть одновременно переведены в фосфатный буфер. Белок (10—200 мг) растворяют в 1,0 M калийфосфатном буфере (pH 7,4; 3,5ч--т-4,0 мл). Для приготовления этого буфера смешивают растворы 1,0 M KH2PO4 (23 мл) и 1,0 M K2HPO4 (77 мл) и добавляют к смеси 0,5 мг/мл этилового эфира /г-гидроксибензой-ной кислоты (в виде раствора в изопропаноле). Раствор белка с помощью пипетки постепенно добавляют к эупергиту С (1,0 г). Для этой операции лучше всего использовать широкогорлую колбу с внутренним диаметром 15—20 мм; в случае слишком маленького диаметра колбы не может быть гарантировано необходимое проникновение жидкости в шарики. Колбу плотно закрывают пробкой и оставляют на 16—72 ч при комнатной температуре (21—250C). Перемешивания не требуется. Затем реакционную смесь переносят на пористый стеклянный фильтр (пористость 2—3) и промывают гель дистиллированной водой (2 раза по 50 мл), 1,0 M NaCl (4 раза по 50 мл) и в заключение буфером (2 раза по 50 мл), в котором предполагается использовать продукт. В качестве консерванта добавляют 0,5 мг/мл этилового эфира л-гидроксибензойной кислоты.
2) Удаление избытка оксирановых групп обычно не обязательно; при необходимости такой обработки см. разд. 10.2.
10.1.2. Другие варианты. Реакция белков с оксирановыми группами может протекать в широком диапазоне pH (pH 0-е--т-12). Присоединение происходит как в кислотной области (например, в среде HCl—NaCl при pH Оч-З или в ацетатном буфере при pH 4ч-6), так и в сильнощелочной области (например, в 0,2 M Na2HPO4). Для каждого конкретного белка рекомендуется определять оптимальное значение pH связывания. Для многих белков оптимальна ионная сила 1,0 моль/л ка-лийфосфата, хотя описаны случаи, когда при более низкой ионной силе были достигнуты лучшие результаты.
Ю.2. Образование производных эупергита С с низкомолекулярными соединениями
10.2.1. Реакции с меркаптанами. Эти эксперименты обязательно надо проводить в вытяжном шкафу.
1. В водной среде. Предварительно оксирановые шарики (1 г) промывают пять раз водой и фильтруют под вакуумом. 2 ммоля меркаптосоединения (например, бензилмеркаптана)
Получение матриц
35
растворяют в воде (2 мл) и с помощью NaOH доводят pH до 8-7-9. Раствор меркаптана добавляют к шарикам, тщательно перемешивают и оставляют смесь на ночь при 25 °С. Продукт промывают шесть раз дистиллированной водой (10 объемов). Степень присоединения контролируют с помощью элементного анализа на серу.
2. В неводной среде. Метиловый спирт [4 г; метанол не на» до абсолютировать; при содержании воды 10% (об./об.), напротив, реакция ускоряется], содержащий тритон В [5 мг, 40%-ный (масс/об.) раствор гидроксида бензилтриметиламмония в метаноле], смешивают с бензил меркаптаном (180 мга а; 1,5 ммоля) и добавляют эупергит С (1 г). Смесь встряхивают в течение 72 ч при комнатной температуре (230C), затем фильтруют через пористый стеклянный фильтр и промывают метанолом (5-кратным объемом). Количество присоединенного меркаптана контролируют с помощью анализа на серу.
10.2.2. Реакции с гидроксилсодержащими соединениями, например с н-гексанолом. Металлический натрий (250 мг) растворяют в «-гексаноле (125 г) и добавляют эупергит С (25 г). Суспензию нагревают до 800C и выдерживают при этой температуре в течение 48 ч. По охлаждении смеси избыток гексанола отделяют фильтрованием; твердый носитель промывают метанолом (5 по 100 мл) до отсутствия w-гексанола в промывных водах. Продукт сушат в вакууме при 40 0C в течение 48 ч. Определяют содержание гексанольных остатков методом Цейзе-ля. 20% оксирановых групп связываются с гексанолом, в то время как 80% оксирановых групп превращаются в диол в результате щелочного гидролиза.
10.213. Реакция с диалкиламинами, например с гексаметилен-диамином. Гексаметилендиамин (800 мг) растворяют в дистиллированной воде (9 мл) и добавляют эупергит С (1 г). Смесь осторожно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, затем переносят на пористый стеклянный фильтр и твердую фазу промывают водой до нейтральной реакции промывных вод. В заключение носитель промывают этанолом три раза и сушат в вакууме в течение 72 ч при комнатной температуре. Для контроля степени присоединения определяют содержание хлора после добавления к навеске носителя известного количества соляной кислоты. Реакция присоединения гексаметиленди-амина должна пройти полностью (100%), т. е. 1 моль оксирановых групп присоединяет 1 моль гексаметилендиамина.
10.2.4. Удаление избыточных оксирановых групп (после иммобилизации лиганда). Содержание оксирановых групп составляет 800—1000 моль/г сухих шариков. Эта концентрация эпок-
