Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 11

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 106 >> Следующая

9.2.4. Покрытие внутренней поверхности трубки поливиниловым спиртом в присутствии терефталевого альдегида с образованием продукта IV6. Трубку III обрабатывают водным раствором 2,2% (масс/об.) поливинилового спирта (20 мл) в концентрированной соляной кислоте (0,2 мл) с добавкой 1 мл 0,1 M терефталевого альдегида в диоксане. Смесь в трубке циркулиру-ется в течение 30 мин при 250C Трубку промывают водой, заполняют 0,1 M соляной кислотой, выдерживают еще 15 ч, затем вновь промывают водой.
9.2.5. Активация внутренней поверхности трубки 2,4,6-трихлоро-симм-триазином с образованием продуктов Va и V6 [26]. Труб-
_Получение матриц__ЗІ
Рис. 10. Структура активированных производных трубок из поливинилаце-
татэтилена.
ку IVa или IV6 длиной 100 см заполняют 20%-ным NaOH (10 мл) и оставляют на 30 мин при комнатной температуре; жидкость удаляют отсасыванием в вакууме и добавляют 10%-ный (масс/об.) раствор 2,4,6-трихлоро-силш-триазина в диоксане (10 мл). Циркуляцию раствора продолжают 10 мин, затем реакцию прекращают путем добавления 20%-ной (об./об.) уксусной кислоты (10 мл). Трубку промывают диоксаном и водой.
9.2.6. Модификация внутренней поверхности трубки реакцией с 2~(3-аминофенил)-1,3-диоксоланом с образованием продуктов
О
R-O-C-CH3 (I)
j NaOH
R-OH (И)
о
CHj о-@-с но.
R-0-CHfCH-CHr0-©-CHO (III) ОН
а) поливиниловый спирт-НСІ
б) поливиниловый спирт-НСІ терефталевый альдегид
32
Глава J
Via и VI6. Трубку IVa или IV6 длиной 500 см обрабатывают 1,0 M раствором 2-(3-аминофенил)-1,3-диоксолана (2 мл) в диоксане и концентрированной соляной кислотой (0,5 мл). Смесь циркулируют в трубке в течение 4 ч при 40 0C; трубку промывают 0,01 M соляной кислотой и водой.
9.27. Диазотирование с получением продуктов VIIa и VII6. Смесь 0,5MHCl (10 мл) и 1,0 M NaNO2 (1 мл) при 00C циркулируют в течение 30 мин через трубку VIa или VI6 длиной 100 см. Трубку промывают ледяной водой. Трубка подготовлена для иммобилизации ферментов.
9.3. Иммобилизация ферментов на поверхности активированных трубок
9.3.1. Иммобилизация трипсина на триазинактивированной трубке. Активированную трубку Va или V6 длиной 100 см, содержащую дихлоро-сылш-триазиновые группы, обрабатывают раствором трипсина (5 мг) в фосфатном буфере (pH 7,0, / = = 0,15) (5 мл). Циркуляцию раствора фермента продолжают в течение 3 мин, затем реакцию иммобилизации останавливают путем добавления 1,0 M аммиачного раствора NH4Cl (pH 9,2; 3 мл). Трубку промывают фосфатным буфером (pH 7,0), 0,5M NaCl и дистиллированной водой.
9.3.2. Иммобилизация трипсина на трубках VIIa или VI16 реакцией азосочетания. Раствор трипсина (5 мг) в фосфатном буфере (pH 7,0, /==0,15) (5 мл) вводят в реакцию с трубкой Vila или VI16 (длина 100 см) при O0C Циркуляцию раствора фермента продолжают в течение 2 ч, затем реакцию останавливают и удаляют раствор отсасыванием в вакууме. Трубку промывают фосфатным буфером (pH 8,0), 0,5 M NaCl и дистиллированной водой. Промывные растворы собирают в мерную колбу на 100 мл и определяют содержание белка с помощью реагента Фолина; рассчитывают количество иммобилизованного фермента. Трубку заполняют водой и хранят при 4 0C
9.3.3. Иммобилизация глюкозооксидази на трубках VIIa или VII6 реакцией азосочетания. Трубку VIIa или VII6 длиной 50см с раствором 2 мг глюкозооксидазы в 0,5 M триэтаноламинном буфере (pH 8,0; 4 мл) выдерживают J ч при O0C при циркуляции раствора фермента. Продукт промывают 0,5 M триэта-ноламинным буфером (pH 8,0), 0,5 M NaCl и дистиллированной водой.
Получение матриц
33
9.3.4. Иммобилизация глюкозооксидази на трубке VI6 посредством глутарового альдегида. Трубку VI6 длиной 50 см активируют путем циркуляции в ней 5% (об./об.) раствора глутарового альдегида в фосфатном буфере (pH 8,0, / = 0,15) при комнатной температуре в течение 1 ч. Продукт (трубка VIII6) промывают водой. Трубку VIII6 длиной 50 см заполняют раствором глюкозооксидазы (3 мг) в фосфатном буфере (3 мл; pH 8,0, / = 0,15); циркуляцию раствора фермента в трубке продолжают в течение 4 ч при комнатной температуре. Трубку промывают фосфатным буфером (pH 8,0), 0,5 M NaCl и дистиллированной водой.
10. ЭУПЕРГИТ С
Эупергит С (фирма Rohm Pharma, Дармштадт) представляет собой оксирановые акриловые шарики, полученные сопо-лимеризацией метакриламида, метиленбисакриламида, глици-дилметакрилата и/или аллилглицидилового эфира. Эупергит С — электронейтральная и гидрофильная матрица. В виде водной суспензии эпоксид химически стабилен (в интервале pH 0-н ~ 12) в течение нескольких часов при комнатной температуре, а в сухом виде — в течение месяцев при —30 0C Химическая природа связи лиганд — матрица обеспечивает необратимую иммобилизацию лигандов (таких, как белки) на этой матрице без отщепления лиганда от матрицы в интервале pH 1-ї-10.
Шарики имеют средний диаметр 150+20 мкм (для высокоэффективной хроматографии эупергит С выпускается в виде микрошариков со средним диаметром 30 мкм) с макропористой структурой и низким уровнем удерживания воды. При использовании под давлением эупергит С имеет преимущество по сравнению с агарозными шариками. В случае эупергита С не наблюдается увеличения сопротивления потоку при увеличении давления от 0,1 до 1,0 бар. Напротив, при использовании шариков агарозы сопротивление потоку в колонке увеличивается, а при 0,6 бар колонка вообще забивается. Поэтому эупергит С вполне пригоден даже для процессов с нисходящим движением потока через закрепленный слой сорбента, обеспечивая постоянные и высокие скорости потока в течение длительного времени.
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 106 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed