Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
О CH2OH
CH2= CH- C-NH-C-CH2OH CH2OH
Рис. 4. Мономер для получения гелей трисакрила. -CH2-CH-CH2-CH-CH2-Ch-CH2-CH-CH2-CH-
CO со со со со I i I i I
NH R NH R NH
C(CH2OH)3 C(CH2OH)3 C(CH2OH)3^
Рис. 5. Структура трисакриловых ионообменников. R = NHCH2COOH (карб-
оксиметилтрисакрил), NH(CH2hNEt2 (диэтиламиноэтилтрисакрил), NHCH2CH2CH2SOaH (сульфопропилтрисакрил), NH2 (незамещенный трис-
акрил).
Основная особенность этих макромолекул состоит в наличии трех гидроксиметильных групп и одной алкиламидной группы в каждом повторяющемся звене. Благодаря наличию этих функциональных групп полимеры имеют высокую гидрофиль-ность и удобны для разделения биологических макромолекул, особенно белков, и клеток.
Амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиольные остатки создают микроокружение, благоприятствующее подходу гидрофильных веществ (белков) из раствора к поверхности полимера. Полиэтиленовая подложка расположена под слоем гидроксиметильных групп. Матрицы этого типа имеют очевидное преимущество
Получение матриц
25
по сравнению с носителями на основе полиакриламида и гидр-оксиметилметакрилата, отличающихся значительной гидрофоб-ностью. Кроме того, установлено, что шарики трисакрила не взаимодействуют с клетками, что можно объяснить неуглеводной природой трисакрила в отличие от классических хромато-графических матриц. Возможно, что трисакрилы найдут важное применение в высокоэффективной хроматографии ввиду их устойчивости к повышенному давлению (до 3 бар) (рис. 6).
0,5 i1o 1,5 20 Давление.бар
Рис. 6. Влияние давления на скорость потока для ДЭАЭ-трисакрила.
Трисакриловые гели очень гидрофильны, не подвергаются биодеградации и стабильны при низкой (—2O0C) и высокой (1210C) температурах, а также к действию денатурирующих агентов. Они также устойчивы при кислотных pH, но менее стабильны при высоких pH из-за медленного гидролиза амидной связи. Наиболее важные свойства трисакрилов приведены в табл. 5.
Пределы исключения ионообменников, определенные по хро-матографическому поведению глобулярных макромолекул, оказались высокими. На рис 7 показано сравнительное поведение трисакрильной матрицы, на основе которой синтезируются ио-нообменники, и матрицы для гель-фильтрации — ультрогеля AcA 34. Из рис. 7 видно, что влияние молекулярной массы на параметры элюирования для трисакрилового геля незначительно.
Таблица 5. Некоторые характеристики трисакриловых гелей
Характеристика геля
КМ-трисакрил ДЭАЭ-трис-акрил СП-трисакрил
40-80 40—80 >ю7 40—80
200 300 230
4,7 6,2, 10,7 0—13 Очень хорошая
0—13 Очень хорошая 0—13 Очень хорошая
Очень хорошая Хорошая Очень хорошая
Очень хорошая Очень хорошая Очень хорошая Очень хорошая Очень хорошая Очень хорошая
Незначительное Незначительное Незначительное
Размер шариков, мкм
Предел исключения по молекулярной массе
Плотность ионизованных групп, мкэкв./мл
рК карбоксильной группы
рК аминогрупп
рК сульфоната
pH-стабильность
Устойчивость к действию ПАВ
Устойчивость к действию
денатурирующих агентов Устойчивость к нагреванию Устойчивость к микробной деградации
Изменение объема при изменении pH и ионной силы
по молекулярной массе
Рис. 7. Изменение константы Kav в зависимости от молекулярной массы для трисакрила (/) и ультрогеля AcA 34 (2),
Получение матриц
27
Таблица 6. Емкости КМ-трисакрила и ДЭАЭ-трисакрила
Емкость геля КМ-трис-акрнл D3A3-TpHC-акрнл
Полная, мкэкв./мл 200 300
По бычьему сывороточному альбуми- — 105
ну8, мг/мл
По гемоглобину человека6, мг/мл По цитохрому с", мг/мл 95 85
95 —
а В 0,05 M трис-НО, pH 8,0, с концентрацией раствора бычьего альбумина 10 мг/мл.
6 Для KM в 0,05 M ацетатном буфере, pH 5,0; для ДЭАЭ в 0,05 M трис-HCl буфере, pH 9,0. Концентрация раствора гемоглобина 5 мг/мл.
в В 0,05 M ацетатном буфере, pH 5,4, с концентрацией цнтохрома 3 мг/мл.
Емкость ионообменников на основе трисакрилового геля зависит от pH, ионной силы, температуры, природы буфера и концентрации образца (табл. 6).
6.1. Получение трисакрилового полимера в форме шариков
В лаборатории трисакриловый полимер можно получить по методике, описанной во французском патенте (№ 7 702 391).
1) В 1 л воды растворяют М-акрилоил-2-амино-2-гидрокси-метил-1,3-пропандиол (330 мг/мл) и ^Ы'-диаллилтартрадиамид в качестве поперечно-сшивающего агента (40 мг/мл).
2) Раствор нагревают на водяной бане до 55 °С и добавляют персульфат аммония (120 мг) и ^^№,№-тетраметилэти-лендиамин (1,6 мл).
3) Полученную смесь немедленно выливают в керосин (2 л) и перемешивают для образования эмульсии. В этих условиях протекает экзотермическая полимеризация с образованием твердых сферических частиц.
4) Частицы отделяют декантацией раствора и промывают 1%-ным (об./об.) водным раствором тритона X-100; после отделения фракции 40-5-80 мкм (сита) продукт окончательно промывают 1,0 M NaCl, водой и хранят при 4 °С в 0,02%-ном (масс/об.) NaN3 (конечная концентрация).
6.2. Введение аминогрупп на шарики трисакрила (трисакрил^Н2)
