Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 2. Влияние типа агара и содержания серы на адсорбционную емкость по цитохрому с [2]. (Приведено с разрешения.)
Гель Содержание полисахарида, % (масс./об.) Адсорбционная емкость Содержание серы, %
Продажная агароза 6 0,08 о,п
ЭКД-агароза 0,01 0,02
Продажный агар (шарики) 6 0,24 0,37
ЭКД-агар (шарики) 6 0,06 0,05
Восстановленный ЭКД-агар 6 0,01 0,01
(шарики)
Вторичная структура агарозы, характеризующаяся наличием линейных полисахаридных цепей без ковалентной поперечной сшивки, вызывает дополнительные проблемы, включая: 1) потерю термической устойчивости; 2) уменьшение объема или 3) изменение степени набухания в средах с различной ионной силой и диэлектрической проницаемостью; 4) затрудняется замораживание и высушивание агарозной матрицы и 5) легкую растворимость в присутствии денатурирующих или хаотропных ионов. В результате действия многих органических растворителей происходят существенные и необратимые изменения структуры агарозы.
Структурная целостность, жесткость и пористость агароз-ного геля определяются его вторичной структурой, характеризующейся наличием нековалентных взаимодействий (водородных связей) между различными агарозными цепями.
На рис. 2 представлена предполагаемая структура агарозной матрицы. Агароза обладает достаточно большими порами, в которые легко проникают белки с молекулярными массами до нескольких миллионов, и в то же время жесткость агарозы достаточна для придания ее частицам сферической формы, что обеспечивает хорошую скорость потока. Полагают, однако, что сохранение размеров пор связано с образованием водородных
14
Глава 1
связей между тремя нитями тройной спирали агарозных цепей. Любой фактор, нарушающий эти связи, может вызвать разрушение общей структуры матрицы и растворение агарозы. Именно разрывом этих связей обусловлена термическая неустойчивость агарозы. Если в аффинной хроматографии приходится в качестве элюентов использовать мочевину, гуанидинхлорид,. хаотропные ионы и некоторые поверхностно-активные вещества (ПАВ), разрушающие водородные связи, то агарозу следует поперечно сшивать (с эпихлорогидрином), что значительно
повышает устойчивость матрицы, придает ей механическую прочность и большую устойчивость к хаотропным реагентам.
2,2. Получение поперечно-сшитой агарозы
1) Готовят суспензию агарозных шариков (100 мл) в 1,0 M NaOH (1 л), содержащем эпихлорогидрин (10 мл) HNaBH4 (0,5 г).
2) Смесь нагревают при Рис. 2. Структура агарозы. 60 °С в течение 2 ч с перемешиванием. Для этого удобна
использовать роторный испаритель; колбу со смесью присоединяют к роторному испарителю и нагревают на водяной бане при 600C при включенном моторе. (Внимание! Не используйте вакуум, а надежно закрепите колбу или пробирку на вращающемся валу с помощью подходящего зажима.) Этот метод перемешивания имеет преимущество перед перемешиванием с помощью магнитной мешалки, поскольку в последнем случае может происходить разрушение шариков, особенно если перемешивающий стержень не имеет центрального выступа.
3) По окончании реакции шарики промывают горячей водой до нейтральной реакции промывных вод. Такой носитель можно использовать без дальнейшей обработки; однако в результате проведенных операций в матрицу может вводиться некоторое количество карбоксилатных групп. Для их удаления носитель помещают в автоклав и выдерживают там 1 ч при 12O0C в 2,0 M NaOH (50 мл), содержащем NaBH4 (0,25 г); затем шарики промывают 1,0 M NaOH (150 мл), содержащим 0,5% (масс/об.) NaBH4.
4) Подготовленный таким образом носитель промывают холодной водой, суспендируют в холодной воде и доводят до рН4 с помощью уксусной кислоты.
Получение матриц
15
5) Шарики хранят при 40C (не замораживая). В случае хранения в течение более чем нескольких недель необходимо добавить NaN3 (до конечной концентрации 0,02% масс/об.) для предотвращения микробного роста.
2.3. Получение агарозных шариков
Для аффинной хроматографии обычно используют гранулированную агарозу (в форме шариков); она производится несколькими фирмами (табл. 3). Получение агарозных шариков
Таблица 3. Перечень некоторых фирм — производителей (или поставщиков) носителей, применяемых в аффинной хроматографии
В дополнение к приведенным здесь сведениям читателю рекомендуется обратиться к фирменным проспектам и описаниям, которые всегда сопровождают поставляемую продукцию и содержат уточнения.
Amicon Corporation. Аффинные матрицы на основе найлона (Matrex 101— 102), карбоксилированные найлоны, поперечно-сшитая сферическая агароза (Matrex Gel), иммобилизованные красители (Matrex Gel Dye Ligand Screening Kit) и фенилборная кислота. Колонки с иммобилизованными красителями (по специальному заказу). Колонки и системы для ультрафильтрации.
ВІо-Rad Laboratories. Строительные блоки для получения аффинных адсорбентов, содержащие вставки с концевыми амино-, карбоксильными, тиол-фенилртуть- и активированными карбоксильными группами; агарозные гели (Biogel А), КМ-биогель A (CM-Biogel А), полиакриламидные гели (Bio-Gel P). Хроматографическое оборудование и колонки.
