Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
S-АМЯА S-ацетилмеркаптоянтарный ангидрид
АФБК ж-аминофенилборная кислота
АЭКМ аминоэтилкарбамилметил
БСА бычий сывороточный альбумин
ГМДА гексаметилендиамин
ГПЭС Ы-2-гидроксипиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНФ динитрофенил
ДТТ дитиотреитол
ДЭАЭ диэтиламиноэтил
КБТ Ы,Ы'-карбонилди-1,2,3-бензотриазол
КДИ Ы,Ы'-карбонилдиимидазол
КДТ 1Ч,М'-карбонилди-1,2,4-триазол
KM карбоксиметил
ПВС поливиниловый спирт
РНК рибонуклеиновая кислота
СП сульфопропил
СПТП N-сукцинимидил-З- (2-пиридилдитио) пропионат
ТМЭД Ы^Ы'^'-тетраметилэтилендиамин
ТНБС 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота
ФХП 2,4,6-трифторо-5-хлоропиримидин
ЭДАК хлорогидрат 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭЭДХ Ы-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин
ADP аденозиндифосфат
AMP аденозин-5'-монофосфат
ATP аденозинтрифосфат
Con А конканавалин А
CPG стекло с контролируемым размером пор
.CTP цитидинтрифосфат
GGT ч-глутамилтранспептидаза
GTP гуанозинтрифосфат
NAD никотинамиддинуклеотид
ОСНОВЫ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
Многие химические вещества, используемые при получении аффинных адсорбентов, токсичны, некоторые — едкие или огнеопасные. При описании методик далее обязательно обращалось внимание на меры предосторожности. При работе с органическими веществами необходимо придерживаться обычных правил техники безопасности, т. е. использовать лабораторную одежду, защитные очки и перчатки. С особой предосторожностью следует выполнять такие операции, как перегонка, использование вакуумных линий и газов в баллонах. Настоятельно рекомендуется использовать для работы вытяжной шкаф.
Глава L
ПОЛУЧЕНИЕ МАТРИЦ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
Матрица, используемая для получения аффинных адсорбентов, должна соответствовать ряду требований, среди которых отметим наиболее важные: матрица должна иметь открытую и крупнопористую структуру и состоять из жестких сферических частиц, однородных по размеру и пористости; частицы должны быть химически и биологически инертными, но в то же время легко образовывать производные предпочтительно при комнатной температуре и в водной среде; в идеальном случае эти химические производные должны обеспечивать иммобилизацию лигандов, быть стабильными в течение определенного времени и не приводить к разрушению ни носителя, ни лиганда, особенно если последний — белок; для проведения современных экспериментов матрица должна выдерживать повышенное давление (5 бар) и хранение при низких температурах (например, —30 °С). Очевидно, что ни одна из доступных на сегодняшний день матриц не отвечает полностью всем этим требованиям.
2, АГАРОЗА
В качестве матрицы в аффинной хроматографии наиболее широко используется агароза. Это очищенный линейный содержащий галактозу (рис. 1) аэрогель-ксерогелевый коллоид, выделяемый или из агара или непосредственно из содержащих агар морских водорослей. Агароза характеризуется хорошей гелеобразующей способностью; она относительно биологически инертна и поэтому удобна в качестве носителей не только для аффинной хроматографии, но также и для гель-фильтрации. Агар и агароза — не синонимы, и различные агарозные препараты также могут значительно отличаться друг от друга по своим физико-химическим свойствам. Некоторые агарсодержа-щие морские водоросли приведены в табл. 1.
12
Глава 1
Таблица 1. Биологическое происхождение и структурные особенности галактанов красных морских водорослей
Галактан Фракция Углеводные единицы
Агар-агар Агароза Агаропектин Я-фракция к-Фракция і-Фракция D-Галактоза 3,6-Ангидро-Ь-галактоза
Каррагинан Фурцелларан Б-Галактоза-2-сульфат о-Галактоза-2,6-дисульфат О-Галактоза-4-сульфат 3,6-АнгидроЛЭ-галактоза О-Галактоза-4-сульфат 3,5-Ангидро-Э-галактоза-2-сульфат D-Галактоза D- Галактоза-4-сульфат 3,6-Ангидро-0-галактоза
2.1. Структура агарозы
Агар состоит из двух фракций: высокозаряженной агаро-пектиновой фракции и нейтральной агарозной фракции. «Нейтральная» агарозная фракция построена из повторяющихся ага-робиозных звеньев, состоящих из чередующихся 1,3-связанных ?-D-галактопиранозильных и 2,4-связанных 3,6-ангидро-а-Ь-га-лактопиранозильных остатков (рис. 1).
Однако дальнейшие исследования показали, что такое представление о структуре агарозы слишком упрощено; на самом деле агарозная фракция неоднородна и содержит как высокозаряженные, так и нейтральные молекулы агарозы. Агароби-озная матрица может содержать сульфатные, метоксильные, кетальпируватные и карбоксильные группы, хотя не всегда одновременно.
Содержание сульфата в агарозе часто используется как показатель ее чистоты: чем ниже этот показатель, тем лучше качество, поскольку многие нежелательные свойства агара приписываются наличию в нем ионных групп, главным образом,
CH2OH о
L
Рис. 1. Повторяющееся структурное звено агарозы. Для ясности водо* и родные атомы не указаны [1].
Получение матриц
13
вероятно, сульфата. Коммерческая сферическая агароза содержит до 0,37% (масс/об.) серы и, как видно из табл. 2, широко различается по содержанию сульфатных групп. Если ионные группы оказывают нежелательное влияние на разделение, то полезно предварительно обработать агар борогидридом натрия для удаления этих групп. Восстановление агарозных шариков проводят действием NaBH4 в щелочной среде. Например, ага-розу (7 мл) суспендируют в 1,0 M NaOH (5 мл), содержащем 2 мг/мл NaBH^ восстановление проводят в течение 2 ч, а затем шарики промывают водой.
