Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2) Готовят раствор агарозы (кипячением в круглодонной колбе). Для получения раствора агарозы с содержанием >3% (масс/об.) необходимо использовать автоклав при давлении 2 бар.
3) Перед нагреванием колбу со смесью агарозы и растворителя вакуумируют. Для достижения полного растворения
Таблица 4. Экспериментальные данные по получению шариков агарозного геля методом суспензионного гелеобразования
Концент- Размер шариков, меш (стан-
рация агарозы (г агарозы Объем толуола, Объем CCl4, мл Стабилизатора Количество стабилиза- Скорость перемешивания,
на 100 мл воды)а мл тора, г об/мин дарт. США)
6 450 150 Сесквиолеат сор-битана 4,5 1700 100—170
8 445 155 Моностеарат по-лиоксиэтилен-сорбитана 5 1500 60—100
10 440 160 Моностеарат по-лиоксиэтилен-сорбитана 15 1700 170—300
12 430 170 Моностеарат по-лиоксиэтнлен-сорбнтана 25 1700 170—300
Во всех опытах объем воды для растворения агарозы составлял 100 мл.
1 Фирма-поставщик: Atlas Chemical Industries Inc., Chemicals Division (США).
при необходимости нагревание повторяют, особенно в случае приготовления растворов, содержащих >10% (масс/об.) агарозы.
4) Органическую фазу (см. табл. 4), содержащую стабилизатор, предварительно нагревают до 50 0C на водяной бане.
5) Органическую фазу добавляют к раствору агарозы и включают мешалку.
6) Через 1 мин реакционную колбу охлаждают холодной водой.
7) Через 5 мин шарфики .переносят на пористый стеклянный
2—139
18
Глава 1
фильтр и промывают эфиром (3 раза по 200 мл) для удаления органического растворителя.
8) Затем добавляют воду (1 л) и декантируют эфирный слой.
9) Остатки эфира, растворенного в водной фазе, удаляют, поместив реакционную смесь в колбу Бюхнера и вакуумируя последнюю на водоструйном насосе.
10) Для удаления очень мелких частиц гранулы промывают на фильтре и сите.
11) Однородность формы и диаметра шариков контролируют, рассматривая пробу носителя под микроскопом после окраски цибакроном голубым (как описано в гл. 6).
2.5. Свойства суперозы 6В, агарозного геля
для высокоэффективной аффинной хроматографии
Супероза 6В — агарозная матрица с высокой степенью сшивки, образующая очень жесткий гель. Эффективность этой матрицы в качестве носителя для адсорбентов, используемых для разделения в условиях высокоэффективной хроматографии, обусловлена наличием поперечных сшивок, а также однородностью частиц по размеру (который характеризуется узким интервалом 20—40 мкм). По данным фирмы-производителя (Pharmacia) в колонке (1,6X60 см) при скорости тока 0,3 мл/мин создается, как правило, обратное давление менее 1 бар. Область фракционирования по молекулярной массе составляет 104ч-4-106 для глобулярных белков и 104^lO6 для полисахаридов.
Супероза 6В обладает очень низкой неспецифической адсорбцией. Выходы белков обычно превышают 80%. Супероза 6В может быть использована в водной среде в интервале pH 3—14. Гель стабилен в растворах хаотропных реагентов (до 6,0 M). При работе с суперозой 6В можно использовать растворы этиленгликоля, этанола, диметилформамида, тетра-гидрофурана, ацетона, хлороформа, дихлорометана и дихлоро-этана — пиридина (50:50), но не рекомендуется использовать растворы мочевины при концентрациях >6,0 моль/л.
Суперозу 6В можно неоднократно использовать без заметных изменений ее пористости и жесткости для работы в автоклавах при pH 7,0 и 120 °С. Гель выдерживает давление до 4 бар. Обработка растворами анионных, катионных и неионных ПАВ не вызывает изменений свойств геля.
Перед упаковкой колонок с суперозой все растворы рекомендуется фильтровать и дегазировать. Аналогичным образом должны быть обработаны и вводимые на колонку образцы. Фирма Pharmacia располагает дополнительной полезной информацией об этом геле.
Получение матриц
19
2.6. Магнитная агароза (магногель)
Магногель A4R представляет собой агарозу (4% масс/об.)„ сшитую эпихлоргидрином. Его магнитная природа, как и в случае магногеля AcA 44 (см. ниже), обусловлена включением внутрь шариков геля 7% (масс/об.) Fe3O4. Помимо магнитных свойств магногель A4R благодаря поперечным сшивкам обладает термической устойчивостью и стабильностью в присутствии диссоциирующих агентов. Он применяется в случаях, когда колоночный процесс нежелателен, например для разделений в вязких растворах или в присутствии частично растворимых материалов, таких, как клеточные фрагменты.
3. ЦЕЛЛЮЛОЗА
Целлюлоза представляет собой линейные полимеры, состоящие из р-1,4-связанных D-глюкозных единиц с редко встречающимися 1,6-связями.
3.1. Сферическая целлюлоза. Введение
В литературе описано большое число производных целлюлозы, которые постоянно использовались при разработке методологии очистки белков. При этом, однако, всегда отмечалось наличие ряда ограничений в применении целлюлозы не только в обычных методах очистки, таких, как ионообменная хроматография, но и в аффинной хроматографии. Эти ограничения связаны в основном с неблагоприятной физической структурой (недостаточной пористостью) и неподходящей геометрической формой отдельных частиц. Кроме того, дополнительные затруднения для такого использования целлюлозы обусловлены наличием обширных микрокристаллических участков внутри матрицы. Недавно большинство указанных недостатков, относя* щихся к применявшейся ранее фибриллярной, порошкообразной целлюлозе, были устранены; были разработаны новые виды целлюлозных носителей, например пористая сферическая целлюлоза.
