Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Стекло с контролируемым размером пор синтезируют продолжительным нагреванием некоторых боросиликатных стекол при 500—800 0C Результатом такого отжига является разделение стеклянной смеси на боратные и силикатные фазы. После обработки кислотой обрат-
ная фаза растворяется и получается матрица с очень маленькими канальцами и порами (25—70 А). Распределение полученного стекла по размеру пор чрезвычайно узкое; стекло с контролируемым размером пор имеет наиболее однородную пористость из всех доступных на сегодня матриц.
Стекло с контролируемым размером пор содержит 96% диоксида кремния и 4% бората со следами других неорганических оксидов. Основная часть общего содержания бора (до 30% бората) приходится на поверхностные слои стекля. Расположенные на поверхности остатки борсодержащих кислот Льюиса вызывают адсорбцию нуклеофилов, таких, как аминогруппы белков и/или ионы аммония, с образованием положительно заряженных центров, приводящих к неспецифической адсорбции.
Для предотвращения ионной адсорбции ферментов па поверхности стекла его под-
Ввод образца
1
Иммобилизованный крахмал
і f
Последовательность иммобилизованных ферментов
*
Амперметр
Рис. 11. Схема движения образца в системе для определения а-амилазы.
42
Глава J
вергают обработке органическими реагентами, покрывающими силанольные группы, что уменьшает, если не исключает вовсе, ионообменные свойства стекла. Химическая модификация стекла с контролируемым размером пор наиболее часто осуществляется кипячением стеклянных шариков в водных [10% (масс/об.), pH 3,45] или толуольных [10% (масс/об.)] растворах 'у-аминопропилтриэтоксисилана.
Другие производные стекла с контролируемым размером пор могут быть получены с использованием в качестве алкил-силана триэтоксипропилглицидоксисилана (Pierce Chemical Company, США).
13. ДИОЛСВЯЗАННЫЙ СИЛИКАГЕЛЬ Р. Уолтере (R. Я. Walters)
13.1. Введение
Диолсвязанный силикагель (Diol-bonded silica) был использован в качестве носителя в большинстве исследований по высокоэффективной аффинной хроматографии. Хотя такого рода носители коммерчески доступны, они могут быть легко синтезированы из силана и пористого силикагеля, что гораздо дешевле. Схема реакции приведена на рис. 12.
OCH3 о
/ / \
-Si-OH ¦ CH3O-Si-CH2- CH2-CH2-O-CH2-CH-CH2
силикагель I " 3-глицидоксипропил-
и триметоксиеилан
ОН ОН
-Si-O-Si-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH-CH2 диолсвязанный силикагель
Рис. 12. Реакции, используемые для превращения силикагеля в диолсвязанный силикагель.
Реакция может быть проведена в безводной или водной среде. В безводной среде получают монослой силана, в то время как реакция в водной среде приводит к полимерному слою. Методика в водной среде проста и обеспечивает лучшее покрытие для силанольных групп, вызывающих денатурацию и неспецифическую адсорбцию. Полимеризованный слой может быть более устойчив также к гидролитическому расщеплению [39].
Получение матриц
43
В литературе описано много методик силанизации в водной среде; однако при попытках синтезировать носители с различной площадью поверхности встречаются затруднения. По-видимому, на конечную концентрацию силана на поверхности носителя оказывают влияние как концентрация силана, так и соотношение количества силана и площади поверхности силикагеля. Эти параметры не могут быть постоянными ввиду широкого различия в площади поверхности силикагелей (табл. 9). He-
Таблица 9. Степень силанизации различных пористых силикагелей
Размер пор силикаге-O ля, А Площадь поверхности, М2/Га Буфер, мл/г силикагеля Силан, мл/г силикагеля Концентрация силана, % {об,/об.) Из быток силана6 Содержание диола, мкмоль/г Число монослоев
60 500 15 0,75 5 3,0 910 0,8
80 220 10 0,50 5 4,0 720 1,3
100 250 10 0,50 5 4,0 500 0,9
300 250 10 0,50 ¦ 5 4,0 520 0,9
500 50 4 0,10 2,5 4,0 190 1,7
1000 20 4 0,05 * 1,25 4,9 73 1,6
4000 6 5 0,05 1 16 33 2,4
а Данные фирмы-производителя.
6 Отношение использованного количества к необходимому для образования монослоя.
достаточное количество силана не обеспечивает монослойное покрытие силикагеля, в то время как при избытке силана имеет место слипание частиц силикагеля. Поэтому авторы разработали эмпирические методики, которые могут быть использованы для силанизации силикагелей с широким диапазоном площади поверхности.
13.2. Материалы
Используют (З-глицидоксипропил)триметоксисилан, выпускаемый Petrarch Systems (США); силан хранят в эксикаторе. Пригодны силикагели LiChrosorb, LiChrospher и Spheri-sorb любой фирмы-изготовителя. Ацетат натрия и серная кислота должны иметь продажную степень чистоты. Вся стеклянная посуда должна быть тщательно вымыта для удаления любой смазки или жира, которые могут адсорбироваться на сили-кагеле.
13.3. Методы
1) Силикагель и соответствующее количество 0,1 M натрий-ацетатного буфера (pH 5,5; табл. 9) помещают в большую пробирку. Пробирка должна быть достаточно большой, чтобы мож-
44
Глава 1
но было осторожно перемешивать смесь для образования суспензии силикагеля в буфере.
2) Для удаления пузырьков воздуха из силикагеля суспензию обрабатывают ультразвуком в вакууме водоструйного насоса в течение 2 мин.
