Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 57

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 106 >> Следующая

Иммобилизация гепарина на носителе осуществляется с помощью конденсирующего агента ЭЭДХ через шестиуглеродную вставку. Последняя присоединяется к носителю после активации и поперечной сшивки шариков агарозы эпихлорогидрином. Полученный комплекс чрезвычайно устойчив даже в присутствии сильных диссоциирующих агентов. 1 мл геля содержит 4—6 мг иммобилизованного гепарина с активностью 600—900 USP Е/мл.
Использование гепарин-сефарозы в аффинной хроматографии описано далее в разд. 5.
4. ОЧИСТКА 7-ГЛУТАМИЛТРАНСФЕРАЗЫ ИММУНОАФФИННОИ ХРОМАТОГРАФИЕЙ А. Шевчук, Э. Прусак (A. Szewczuk, Е. Prusak)
4.1. Введение
Ч-Глутамилтрансфераза ('у-глутамилтранспептидаза, GGT, КФ 2.3.2.2) катализирует перенос ^-глутамильной группы от различных доноров, включая глутатион, к многочисленным аминокислотным и пептидным акцепторам. Она также катализирует гидролиз соединений, содержащих ^-глУтамильнУю группу. GGT-гетеродимерный мембранный гликопротеин, который мо-
152
Глава 5
жет быть солюбилизирован с помощью ПАВ с получением «тяжелой» формы, либо протеолитическим гидролизом с получением «легкой» формы фермента [19, 20].
Описано много методов очистки различных форм GGT из разных тканей и жидкостей организма; как правило, все предлагаемые методики многостадийны, а выходы относительно низкие. Кроме того, GGT вследствие различий в содержании углеводов и сиаловой кислоты имеет мультимолекулярные формы с различными изоэлектрическими точками, которые плохо разделяются ионообменной хроматографией или аффинной хроматографией на иммобилизованном конканавалине А. Поэтому очистка различных форм GGT с применением иммуноаффинной хроматографии представляется эффективным альтернативным методом.
4,2, Некоторые вспомогательные методики
4.2.L Определение активности GGT. Активность ^-глутамил-трансферазы определяют спектрофотометрически, используя в качестве субстрата ь-глутамил-/г-нитроанилид, а в качестве акцептора — глицилглицин [21], Раствор субстрата содержит: 5 мМ Y-l-глутамиЛ'/г-нитроанилид (13,3 мг в 10 мл) и 50 мМ глицилглицин (66 мг в 10 мл) в 0,1 M трис-HCl буфере (рН7,6). К 0,4 мл раствора субстрата добавляют 0,1 мл разбавленного препарата GGT (0,005-s-0,2 E) и инкубируют смесь при 37 °С в течение 1 —10 мин. Для остановки ферментативной реакции добавляют 1,0 M уксусную кислоту (2 мл) и измеряют оптическую плотность при 407 нм против контрольного образца, полученного тем же способом, но с введением GGT после добавления уксусной кислоты. Строят градуировочный график для определения содержания л-нитроанилина (0-4-0,2 мкмоль). Ферментативную активность указывают в единицах, равных количеству мкмолей образующегося л-нитроанилина в 1 мин.
4.2.3. Гель-электрофорез. Электрофорез в полиакриламидном меряют колориметрически с реагентом Фолина [22]; для построения градуировочного графика используют растворы, приготовленные из кристаллического бычьего сывороточного альбумина. Если белковый образец содержит тритон X-100 к анализируемой пробе добавляют додецилсульфат натрия [23].
4.2.3. Гель-электрофорез. Электрофорез в полиакриламидном геле [на 7%-ном (масс/об.) геле] проводят, как описано в работе [24]: гели окрашивают на белок по методике [24] или на GGT-активность с применением флуоресцентного метода, используя в качестве субстрата 7-(^-ь-глутамил)-4-метилкумарил-амид [25]. Готовят флуорогенный субстрат растворением 7-(^-
Лиганды для иммобилизации
153
-глутамил)-4-метилкумариламида (1,2 мг) в 2,0 M NaOH v(0,02 мл), разбавляют его 50 мМ глицилглицином в 0,1 M трис-HCl-буфере (pH 7,8; 10 мл). Гели с флуорогенным субстратом инкубируют; 7-амино-4-метнлкумарин, образующийся при действии GGT, обнаруживают визуально при УФ-облучении в виде ярко-синей полосы.
4.2.4. Двойная иммунодиффузия. Используют 1,2%-ные (масс/об.) агаровые гели для двойной иммунодиффузии [26]. После образования дуг преципитации гели промывают буфером (0,15 M NaCl в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,4) в течение 3 сут, а затем окрашивают, как описано для полиакриламидных гелей.
4.2.5. Антигены. Антигены, используемые для иммунизации, должны быть очень хорошо очищены, для чего можно использовать "метод иммуноаффинной хроматографии или «классические методы». Чистая GGT из почек быка может быть выделена со-любилизацией фермента в присутствии дезоксихолата натрия с последующей обработкой «-бутанолом, фракционированием сульфатом аммония и хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [27]. Полученный после разделения на сефарозе 6В препарат GGT подвергается протеолитическому гидролизу бромелаином, и полученная GGT (легкая форма) очищается электрофорезом в по-лиакриламидном геле [28]. Чистая GGT из почек крысы (фермент III) может быть получена [29] подобным методом.
4.3. Получение и выделение антител
Поликлональные антитела против GGT почек быка или GGT почек крысы (легкие формы) могут быть получены иммунизацией кроликов (самки, возраст 6—8 нед) путем инъекций в подушечки задних лап эмульсии, состоящей из 50 мкг фермента в 0,5 мл NaCl-натрийфосфатного буфера с 0,5 мл полного стимулятора Фрейнда на животное. Через 2 нед вводят то же количество антигена (50 мкг GGT в 0,5 мл того же буфера), хорошо эмульгированного неполным стимулятором Фрейнда, подкожно в несколько мест шеи. Целесообразно повторить последнее введение еще через 2 нед. Через 10—15 сут берут пробы крови кролика; инкубируют взятые пробы при 37 °С в течение 2 ч, затем оставляют на ночь при 4 0C и отделяют антисыворотку центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. В анализах методом двойной иммунодиффузии антисыворотка при разбавлении 1: 128 (NaCl-фосфатным буфером) все еще дает дуги преципитации с разбавленной GGT (0,025 мг/мл).
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed