Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 68

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 106 >> Следующая

7) Реакцию проводят при комнатной температуре (20— 25 0C) в течение 10 ч с осторожным перемешиванием.
8) Алкил-агарозу отфильтровывают и последовательно промывают (по пять объемов каждого) дистиллированной водой, 0,2 M уксусной кислотой, дистиллированной водой, 20 мМ NaOH, водой, водно-диоксановой смесью (1:1 об./об.), 50 мМ уксусной кислотой и в заключение —20 объемами дистиллированной воды.
9) Перед использованием каждую колонку промывают и уравновешивают буфером, выбранным для хроматографии.
Другая методика [66]
1) Проводят стадию присоединения в смеси диоксан — вода (95: 5, об./об.) в течение 20 ч при pH 9,0 и 22 0C
2) Тщательно промывают адсорбент 2^-3 объемами каждой из следующих смесей диоксан — вода (об./об.): 95:5; 80:20; 60 : 40; 40 : 60 и 20 : 80.
3) Переносят полученный гель в 0,1 M NaHCO3 (pH 9,5), встряхивают 1 ч при комнатной температуре, затем промывают — 20 объемами воды и суспендируют в выбранном буфере.
Для синтеза ряда идентичных адсорбентов, отличающихся только длиной алкильной боковой цепи, надо работать по одной методике. В систематических исследованиях, преследующих цель разработки условий методики очистки, существенно определение плотности лиганда и заряда на адсорбентах по методикам, описанным ниже.
Лиганды для иммобилизации
181
9.2. Синтез аминоалкил-сефарозы-Сп-\Н2 (п = 2ч-12) CNBr-методом
Сефарозу-СгІЧНг получают CNBr-активацией сефарозы 4В с последующей реакцией с а,со-диаминоалканами, содержащими п углеродных атомов в цепи. Методика получения этих гомологических рядов описана выше для рядов алкил-сефарозы-С*.
9.3. Свойства и характеристика адсорбентов
9.3.1. Определение массы сухого вещества. Гель промывают 20 объемами деионизованной воды, берут три навески по 1 г влажного носителя и сушат их в вакууме при 1200C до постоянной массы. Среднюю массу этих трех проб принимают за массу сухого вещества этого конкретного адсорбента.
9.3.2. Определение плотности лиганда на колонках с помощью радиоактивно меченных лигандов.
1) Навески адсорбентов (0,3 г влажного вещества) растворяют в 1 мл 6,0 M HCl и добавляют 10 мл толуольного раствора тритона.
2) Смесь встряхивают до образования прозрачного раствора и определяют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике [состав жидкого сцинтиллятора: 1,4-бис-[2- (5-фенилоксазо-лил)]бензол (0,1 г) + 2,5-дифенилоксазол (8 г) + толуол (666 мл)+тритон Х-100 (333 мл)].
3) Определяют эффективность подсчета радиоактивности, определяя радиоактивность шести идентичных навесок радиоактивно меченного свободного лиганда (например, «-1-[14С]до-децилового спирта), три из которых не содержат добавок, а три другие содержат по 0,3 г (влажное вещество) соответствующего нерадиоактивного адсорбента, растворенного в 1 мл 6,0 M HCl, как описано выше.
4) Используют экспериментально установленную эффективность подсчета радиоактивности для корректировки значений, полученных при определении плотности лиганда.
9.4. Выбор колонки (аффинного сорбента) для очистки конкретной системы
Выбор подходящей замещенной агарозы из данного гомологического ряда, например в ряду алкил-сефароз, проводится на группе адсорбентов, предназначенных для разделения данной системы. «Набор» колонок представляет собой несколько пастеровских пипеток (0,5x5 см), каждая из которых упакована определенным членом гомологического ряда сорбентов, например сефарозой-Сп, где м=1ч-10. Помимо этого, в набор колонок
182
Глава 5
включается две контрольные колонки: одна с немодифициро-ванной агарозой Seph-Co и другая с агарозой Seph-C0N, активированной CNBr и далее обработанной аммиаком с целью частичного моделирования функциональных групп, вводимых после CNBr-активации агарозы и последующего присоединения амина. Подобный набор адсорбентов можно получить для любых других рядов типа Seph-Cj-X.
Когда аликвоты белковой смеси (например, экстракта мышц) наносятся на каждую колонку из подготовленного набора, некоторые белки адсорбируются, а некоторые не связываются. С помощью электрофореза в градиенте полиакриламидного геля смеси несвязавшихся белков с каждой колонки можно показать [65], что увеличение длины углеводородной цепи адсорбента приводит к связыванию большего количества белков на колонке.
9.5. Оптимизация разделения двух ферментов
Для разделения двух ферментов необходимо получить характерные профили адсорбции для каждого, контролируя их концентрацию в несвязавшихся фракциях. Если два фермента различаются по их адсорбционным профилям, то, как правило, имеется возможность выбрать колонку, которая удерживает один фермент и не связывает другой. Например, при хроматографии экстракта мышц кролика на колонке с Seph-C„-NH2 с короткими цепями (я= 2 или 3) не связывается гликогенсинте-таза I, которая связывается на Seph-C4-NH2 и может быть элюи-рована с нее линейным градиентом NaCl. Колонка с Seph-C4-NH2 удерживает синтетазу I, но не связывает гликогеифосфорила-зу ft, для которой в этой серии колонок аффинных сорбентов для связывания в идентичных условиях необходимо наличие углеводородных цепей с пятью или шестью атомами углерода. Следовательно, можно отделить гликогенсинтетазу, пропуская мышечный экстракт через Seph-C4-NH2, а затем выделить фосфори-лазу Ь хроматографией несвязавшихся белков на Seph-C6-NH2; этот подход лежит в основе принципа последовательного фракционирования, описание которого приведено ниже для препаративных количеств [67].
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed