Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
1) Используют неочищенный экстракт, полученный осаждением сульфатом аммония кондиционированной среды из культуры стимулированных ми-тогеном моноядерных клеток периферической крови.
2) После добавления сульфата аммония до 40% насыщения и последующего центрифугирования супернатант диализуют против 20 мМ фосфатного буфера (pH 6,8) и добавляют твердый NaCl до концентрации 4,0 моль/л.
3) Полученный раствор наносят на колонку (1,3X3 см), предварительно уравновешенную буфером А (4,0 M NaCI в 20 мМ фосфате, pH 6,8).
4) Колонку промывают буфером А (80 мл) и элюируют буфером Б
Лиганды для иммобилизации
185
(0,5 M NaCl в 10 мМ фосфате, pH 7,1; 80 мл) со скоростью потока 16— 18 мл/ч.
5) Наносят 80 мл вязкого буфера В (4,0 M гуанидинхлорид в 20%-ном этиленгликоле, pH 12,0); скорость потока понижают до 7—8 мл/ч.
6) В заключение колонку промывают 50%-ным (об./об.) водным этанолом и водой и уравновешивают буфером.
7) Активные фракции (устанавливают путем контроля концентрации белка) объединяют и концентрируют путем лиофилизации или ультрафильтрации на мембране UM-10 Diaflo (в случае фракций, элюированных
Рис. 16. Частичная очистка ФУКЛ из Т-лимфоцитов человека [74]. / — ФУКЛ-активность; 2 — концентрация белка.
4,0 M NaCl). Перед концентрированием фракции, содержащие гуанидинхлорид, необходимо диализовать против фосфатного буфера.
8) Перед анализом ФУКЛ-активности сконцентрированные фракции тщательно диализуют против фосфатного буфера (рис. 16). Измеряют ФУКЛ-активность двустадийным методом образования колонии иммуноком-петентных клеток лейкоцитов периферической крови [70].
9.8.2. Гидрофобная хроматография ферментов из галофильных бактерий с использованием градиентов сульфата аммония с уменьшающейся концентрацией
1) Собирают и центрифугируют клетки из ~6 л 4-дневной анаэробной культуры Halobacterium.
2) Твердый остаток после центрифугирования суспендируют в 4,3 M NaCl в 10 мМ фосфате (pH 7,3) и озвучивают в соникаторе Брэнсона, оборудованном микротипом.
3) Озвученную суспензию центрифугируют в течение 1 ч на ультрацентрифуге при 80 000 ? (30 000 об/мин) и 25 0C
4) Супернатант диализуют против 1,6 M сульфата аммония в 50 мМ фосфате натрия (pH 6,6) и центрифугируют, как описано выше.
5) К супернатанту добавляют твердый сульфат аммония до конечной концентрации 2,5 моль/л.
186
Глава 5
Таблица 11. Элюирование двух галофильных ферментов градиентом сульфата аммония с уменьшающейся концентрацией
Концентрация (NHihSO^ моль/л
Адсорбент Глутаматдегидро- Малатдегидро-
геназа геназа
Сефароза 4В 1,44 IJO
KM-целлюлоз а 1,84 2,06
ГМД-агароза 1.18 —
ДЭАЭ-целлюлоза Не элюируетсяа Не элюируетсяа
Целит 3(И 3,53
Растворимость6 3,01 3,32
а Ферменты элюируются только 0,4 M (NHOzSO4 [глутаматдегидро-геназа при 0,3 M (NH4hSO<]. Однако ферменты можно элюировать градиентом NaCl.
^ Концентрация сульфата аммония, при которой в супернатанте обнаружено 50% активности фермента.
6) Перемешивают в течение 1 ч, суспензию центрифугируют и отделяют супернатант.
Колоночная хроматография. Хроматографию проводят на сефарозе 4В, КМ-целлюлозе, ГМД-агарозе, ДЭАЭ-целлюлозе или целите [7IJ. Весь процесс можно проводить при комнатной температуре.
1) Колонку упаковывают гелем и промывают несколькими объемами 2,5 M сульфата аммония в 50 мМ фосфатном буфере (pH 6,6).
Номер фракции
Рис. 17. Фракционирование с использованием сульфата аммония глутамат-дегидрогеназы (GDH) и малатдегидрогеназы (MDH) из Halobacterium на
КМ-целлюлозе [71].
Лиганды для иммобилизации
187
2) На колонку наносят бактериальный экстракт и промывают 2,5 M сульфатом аммония (около одного объема колонки).
3) Вводят на колонку линейный градиент с уменьшающейся концентрацией сульфата аммония (от 2,5 до 0,5 моль/л) и элюируют при скорости потока 18—35 мл/ч. Анализируют фракции поочередно на глутаматде-гидрогеназную и малатдегидрогеназную активность. Типичные результаты представлены в табл. 11 и на рис. 17.
10. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ИНГИБИТОРОВ В ХРОМАТОГРАФИИ ПЕПСИНОВ
ЮЛ. Приготовление аффинных сорбентов
10.Li. Адсорбенты с низкой концентрацией иммобилизованного ингибитора.
1) Метиловый эфир е-аминокапроил-ь-фенилаланил-о-фенил-аланина (250 мг) растворяют в минимальном объеме диметил-формамида и добавляют триэтиламин (76 мкл) и сепарон Н1000 (гидроксиалкилметакрилатный гель), модифицированный эпихлорогидрином (4 г, содержание эпоксидных групп 800 мкмоль/г).
2) Смесь встряхивают в течение 48 ч, отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и затем этанолом и эфиром.
3) Продукт промывают 6,0 M раствором хлорогидрата гуа-нидина и водой, сушат для анализа до постоянной массы при 1050C и помещают в соответствующий буфер для аффинной хроматографии. (При первоначальной концентрации трипепти-да в растворе 0,02, 0,04, 0,12 и 0,25 моль/л высушенный продукт содержит соответственно 0,85, 1,2, 2,5 и 4,5 мкмоль аффинного лиганда/г.)
10.1.2. Адсорбенты с высокой концентрацией иммобилизованного ингибитора.
1) Метиловый эфир є-аминокапроил-L-фенилаланил- D-фе-нилаланина (11,1 г) растворяют в небольшом объеме метанола и доводят объем до 75 мл буфером Бриттона — Робинсона (pH 11,0).
