Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
6. ЗНАЧЕНИЕ КОНСТАНТ РАВНОВЕСИЯ ДЛЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С МАТРИЦЕЙ
При обсуждении результатов изучения систем фосфоцеллюлоза— альдолаза — фосфат отмечалось, что хотя &as описывает взаимодействие альдолазы с фосфатом в обычных терминах для раствора, константа ассоциации фермент —матрица определяется в некоторой ^степени ограниченностью объема, выбранного для определения тх, т. е. объема, доступного для растворенного вещества. Несмотря на отчасти эмпирический характер, kAx тем не менее удовлетворяет термодинамическому представлению об определении распределения фермента в растворимой и иммобилизованной формах в любой реакционной смеси, для которой
214
Глава 6
концентрация доступных связывающих положений матрицы тх и полная концентрация растворенного вещества тА определяются в той же объемной шкале, что и &АХ. Это важно учитывать при исследованиях природных аффинных систем, таких, как ме-таболитзависимое распределение альдолазы в мышцах [28]. Однако если целью исследования по количественной аффинной хроматографии является определение константы связывания для взаимодействия растворенное вещество — лиганд, то очевидно, что &Ах для связывания растворенного вещества с иммобилизованным на матрице лигандом не должно рассматриваться в качестве константы равновесия соответствующего взаимодействия между растворенным веществом и лигандом в растворе; это связано не только с зависимостью kAx от некоторого эмпирически ограниченного объема при определениях тх и тА, но также и с фундаментальными различиями двух взаимодействий из-за сте-рических эффектов и последствий химической модификации при иммобилизации лиганда. Следовательно, константа равновесия для взаимодействия растворенное вещество — лиганд могла бы, вероятно, быть определена как ?As по экспериментам, в которых растворимая и иммобилизованная формы одного и того же лиганда конкурируют за растворенное вещество; этот метод был применен в работе [14] для исследования взаимодействия между иммуноглобулином А и фосфорилхолином.
7. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
На протяжении последнего десятилетия мы стали свидетелями появления количественной аффинной хроматографии как метода изучения взаимодействий между различными реагирующими веществами. Этот еще относительно молодой метод вызывает несомненный интерес, поскольку в некоторых случаях дает возможность на основе специфического взаимодействия с иммобилизованным реагентом количественно оценивать обратимую реакцию, протекающую в биологических условиях, что продемонстрировано на примере использования оксамат-сефарозы для изучения взаимодействия NADH с различными изоферментными формами лактатдегидрогеназы в неочищенном тканевом экстракте [6]. Другим преимуществом аффинной хроматографии, вероятно, является отсутствие каких-либо ограничений для значений констант равновесия, которые могут быть измерены этим методом. Из двух рассмотренных здесь подробно примеров очевидно, что количественная аффинная хроматография весьма удобна для характеристики относительно слабых взаимодействий (/eAs<1000 M"1), оценка которых вызывает затруднения при использовании других методов, таких, как равновесный диализ, из-за сложности измерения различий между полной и свободной
Характеристика взаимодействий
215
концентрациями лиганда. В то же время показано, что количественная аффинная хроматография также пригодна для оценки взаимодействий, характеризующихся константами равновесия, расположенными на другом конце диапазона значений; это взаимодействия с большими значениями ?As, при которых требуемые для их изучения концентрации лиганда слишком малы для экспериментального определения и количественного измерения в реакционной смеси. Предварительный тщательный диализ растворенного вещества против ряда растворов лиганда с определенной концентрацией, полученных разбавлением раствора с экспериментально определяемой концентрацией, дает возможность определить Va как функцию ms и таким образом получить &as-
Хотя представления, положенные в основу этого обзора, несомненно, пригодны для изучения большого числа взаимодействий, их ни в коем случае нельзя считать подходящими абсолютно для всех систем. Например, ситуация, когда может происходить взаимодействие как А, так и его комплекса с лигандом и матрицей (&ах и Aasx — истинные константы), не рассматривалась в настоящем обзоре; для этой ситуации предложена более сложная теория [19]. Однако, допуская, что единственная истинная константа ассоциации описывает все взаимодействия особого типа между растворенным веществом и матрицей, мы существенно ограничиваем область применения современных методик в количественной аффинной хроматографии с мультива-лентными растворенными веществами [18, 19]. Нетрудно представить себе, что последовательные взаимодействия растворенного вещества с матрицей могут характеризоваться увеличением или уменьшением констант связывания ввиду изменения стери-ческих факторов, связанных с расположением иммобилизованных групп X. Другой, уже обсуждавшийся аспект, ограничивающий применение настоящих методик, связан с допущением идентичности характеристик распределения в геле растворенного вещества и всех комплексов растворенное вещество — лиганд. Кроме того, совершенно не принимались во внимание кинетические соображения (химических процессов и массопередачи), касающиеся процесса распределения. В этом отношении более общая теория количественной аффинной хроматографии [34] показала, что ограничение значений констант скорости, вызванное предполагаемым достижением распределительного равновесия, вероятно, не имеет значения для исследований обычной колоночной хроматографии, но может сделать невозможным применение представленных выше выражений к результатам, полученным при высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием больших скоростей потока. Как отмечено в работе [35], возможное использование аффинной хроматографии для количественных исследований связывания лиганда, несом-
