Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Ниже суммированы практические рекомендации. Размеры колонки должны в 30—100 раз превышать объем образца. Исходная концентрация белка в идеале должна составлять 10— 20 мг-мл-1, самое большее — 30 мг-мл-1. Таким образом, 100 мг белка следует растворить в объеме не меньшем чем 3,5 мл, лучше 5—б мл, и использовать колонку объемом 200—250 см3. Длина колонки должна в 20—40 раз превышать ее диаметр, т. е. для указанного количества белка подходящими будут колонки диаметром 2,5 и длиной 50 см или соответственно 1,8 и 100 см. Идеальные размеры колонки можно определить следующим образом: диаметр=ут/10 см, где т — количество белка в мг, а длина=30Xдиаметр.
Скорости потока ограничиваются максимально достижимыми скоростями протекания буфера. Современные жесткие мате-
Разделение в растворе
213
1риалы выдерживают скорость потока, превышающую скорость (установления равновесия, поэтому необходимо знать рекомендации фирм-изготовителей. Для сефакрилов пригодны скорости йотока до 30 см-ч”1 (30 мл-ч^-см-2), но для ультрагелей рекомендуются меньшие скорости (см. также гл. 7). Время разделения можно вычислить, зная размеры колонки. Если фермент выходит в середине интервала фракционирования для сефакрилов, то в приведенном выше примере с колонкой диаметром 2,5 и длиной 50 см он будет появляться в элюате примерно через 2 ч после нанесения (при скорости потока 30 см-ч-1). Для колонки размерами 1,8X100 см время будет в два раза больше, хотя на длинной колонке разрешение может быть несколько выше. Как уже указывалось, более жесткие материалы с мелкими гранулами позволяют быстрее разделять вещества под давлением, и вполне вероятно, что методы с применением умеренного давления (промежуточные между рутинными операциями, проводимыми при низком давлении, и быстрыми операциями под высоким давлением с использованием техники ЖХВД) получат более широкое распространение.
5.2. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ: ОБЫЧНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Разделять смеси белков посредством электрофореза начали еще в первые годы XX в*. Однако до сравнительно недавнего времени этот метод применялся лишь в аналитических целях. В течение 30 и более лет широко использовался довольно Сложный аппарат Тизелиуса для электрофореза в свободном растворе, однако с его помощью не всегда удавалось добиться полного разделения компонентов. И до сих пор остается справедливым утверждение, что электрофорез — это в основном аналитический метод. Все современные более тонкие электрофоретические методы, такие, как гель-электрофорез, изоэлект-рическое фокусирование и изотахофорез, были разработаны главным образом с целью улучшить способы анализа смесей белков. Тем не менее каждый из этих методов может быть приспособлен для препаративных целей с использованием десятков и даже сотен миллиграммов белковой смеси.
Электрофоретические стадии не так уж часто включаются в схемы очистки ферментов. Для этого есть много причин, в том числе сложность и дороговизна соответствующей аппаратуры, а также трудности, связанные с ее эксплуатацией. Еще одна, не менее важная причина — это то, что электрофоретическое разделение зависит преимущественно от разницы в величине зарядов (или изоэлектрических точек) разделяемых белков — принцип, который широко применяется в ионообменной хрома-
214
Глам 5
тографии. Лишь в случае методов высокого разрешения, таких, как гель-электрофорез (использующий также различия в величине молекул) и изоэлектрическое фокусирование, можно добиться такого разделения, какое трудно получить за одну стадию с помощью других методов. Однако электрофоретические методы с использованием в качестве носителей гелей связаны со многими трудностями, которые будут обсуждаться ниже. Поэтому, хотя препаративный электрофорез может быть очень ценным методом в специализированной лаборатории по очистке белков, начинающим не следует даже и помышлять о нем.
Принципы электрофореза
Молекула белка в растворе при любом значении pH, отличающемся от ее изоэлектрической точки, имеет некий средний целочисленный заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле. Движущая сила определяется величиной напряженности электрического поля Е (В-см-1), умноженной на суммарный заряд частицы г. Этой силе противостоят силы вязкости среды (так же, как и при центрифугировании, см. разд. 1.2), пропорциональные коэффициенту вязкости rj, радиусу частицы г (стоксовскому радиусу) и скорости v.
В стационарном состоянии .
Е-г = 6щгу. (5.1)
Удельная подвижность u=v/E может быть выражена как
“-w- <6-2>
Иногда утверждается, что электрофорез в свободном растворе основан на разделении молекул лишь по величине заряда и не зависит от их размеров. Однако из уравнения (5.2) можно видеть, что подвижность и обратно пропорциональна стоксовскому радиусу. Следовательно, сферическая молекула, имеющая размер 20000 дальтон и заряд —5, должна обладать иной подвижностью, чем молекула с размером 40 000 дальтон и зарядом —5, но такой же, как молекула, которая имеет размер
