Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
220
¦Глава 5
Вертикальный электрофорез
Горизонтальный «блочный» электрофорез не нашел широкого применения, несмотря на то что он не нуждается в сложной аппаратуре. Вертикальный колоночный электрофорез, особенно* в геле, используется значительно чаще. В отсутствие геля есть два способа стабилизировать жидкость в колонке; они используются также при изоэлектрическом фокусировании и изотахо-форезе (см. разд. 5.3). Один из них основан на том же принципе, который используется в горизонтальных системах, — это заполнение большей части объема колонки инертным порошком* так что миграция белка происходит в эффективном объеме между частицами. Второй способ заключается в гравитационной стабилизации жидкости с помощью градиента плотности сахарозы. Плотный раствор сахарозы помещают на дно колонки, а поверх него наслаивают раствор с равномерно убывающей плотностью, так что в верхней части колонки, куда вводят образец, концентрация сахарозы равна или почти равна нулю. Следует отметить, что сахароза в колонке лишь стабилизирует жидкость, сводя к минимуму конвекционные токи. Она лишь немного влияет на миграцию белка вследствие увеличения вязкости по мере перемещения белка вниз по колонке. Это замедляет движение белка, но вместе с тем снижает его диффузию. Обычный способ удалить белок из колонки после электрофореза— это просто дать жидкости стечь и собрать ее в виде фракций с помощью коллектора. Эту операцию нужно делать медленно, чтобы не перемешать отдельные зоны белка, движущиеся вниз по колонке.
Системы вертикального гель-электрофореза
Описанные выше методы дают лишь грубое разделение компонентов смеси. В свободном растворе перекрывание полос из-за перемешивания их за счет диффузии достаточно велико и результаты редко превосходят те, которых можно достичь другими методами. Методы с использованием мелкопористых гелей намного предпочтительнее благодаря свойственной им высокой степени разрешения. Однако в этом случае возникает одно затруднение, связанное с тем, что после завершения электрофореза из геля необходимо извлечь белок, а это можно осуществить только с помощью довольно сложной аппаратуры. Применение гидростатического давления не дает результата, так как поверхностное натяжение слишком велико. Можно раскрошить гель, но даже после размола его до очень мелких частиц выход белка (активного) обычно весьма низок. Более удачный способ— это сбор фракций по мере того, как каждый компонент
Разделение в растворе
221
Гель
Движущиеся
зоны
белков
Элюирующий
буфер
/
\..........
i
- Буфер:_
Проницаемая
поддерживающая
мембрана
Диализная мембрана, непроницаемая для белков
фракций
Рис. 5.17. Элюция белковых зон, выходящих из вертикальной гелевой колонки в процессе электрофореза.
выходит из гелевой колонки в перпендикулярно направленный поток буфера. Этот принцип воплощен в приборе «LKB Unip-hor», серийном аппарате для препаративного электрофореза, (рис. 5.17). К сожалению, образовавшиеся в геле высококонцентрированные зоны белка сильно разбавляются при переходе в буфер, и этот недостаток может быть очень важным, если выделяемый фермент нестабилен в разбавленных растворах. В сочетании с этим прибором можно использовать концентратор непрерывного действия, основанный на ультрафильтрации растворов через полые волокна, так что собираемые фракции можно быстро вновь сконцентрировать. Из-за того что существуют разнообразные методы и самодельные приборы, в литературе описано много способов препаративного электрофореза, и начинающему следует познакомиться с ними, прежде чем решить,., какая система удовлетворяет его нуждам и бюджету [134— 138].
Буферные системы
Состав буфера, используемого для контроля pH в ходе-электрофореза, имеет весьма важное значение, поскольку ток,, протекающий по «каналу», в котором происходит разделение,., создается ионами буфера. Очень подвижные ионы (ионы металлов Na+, К+, Mg2+ и простые анионы F-, Cl-, Br~, S042-,.
:222
Глава 5
0,2 М буфер
0,05 М буфер
0,2 М буфер
Электродная камера
Разделительный канал Л
Электродная камера
— ¦—обдб1 -
_г_-^ЙЙй^" +
Буфер, содержащий анионы Буфер, содержащий анионы Катионный буфер с низкой подвижностью с высокой подвижностью ( Л * + 1)
Рис. 5.18. Расположение буферов в непрерывной (Д) и «прерывистой», или дискретной (?), буферных системах.
НР042-) несут большой ток благодаря своей высокой мобильности. Это ведет к нагреву, и, если только нет особых причин использовать подобные ионы, их следует исключить. Объемистые органические ионы имеют намного меньшую подвижность, особенно если они входят в состав буферов типа п— +1 или л=—1 (см. разд. 6.1). С другой стороны, вполне вероятно, что небольшие простые катионы более эффективно препятствуют белок-белковым взаимодействиям, чем объемистые органические ионы; таким образом, если возникает проблема белок-бел-ковых взаимодействий, следует использовать некоторые простые соли.
