Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Колонку необходимо заполнять по возможности в один прием, чтобы предотвратить разделение гранул по размерам в процессе оседания (см. рис. 1.11). С этой целью используют суспензию, объем которой не более чем в два раза превышает объем осевшего материала. Заполнение колонки следует производить как можно быстрее без использования давления. Хороший способ создать более высокую скорость потока — это присоединить снизу к колонке длинную, но не слишком узкую трубку, с тем чтобы увеличить общую высоту столба жидкости; тогда падение давления в самой колонке окажется выше.
Очень важным условием хорошего разделения является нанесение образца. Чем ровнее он нанесен, тем лучше будет конечный результат. С успехом используются аппликаторы, благо-
14—1078
210
Глава 5
Рис. 5.10. Неправильный (А) и правильный (Б) способы установки колонки для гель-фильтрации (или любой другой) по отношению к УФ-монитору и коллектору фракций. Длина соединительной трубки должна быть минимальной, причем трубка должна быть как можно уже, но не затруднять потока.
даря удачной конструкции которых можно добиться равномерного потока жидкости через всю поверхность геля (см. рис. 1.8). Нельзя допускать, чтобы между поверхностью геля и аппликатором создавалось значительное мертвое пространство, так как это приводит к смешиванию слоев (см. рис. 1.10). Не следует применять растворы образца, имеющие меньшую плотность, чем буфер (например, растворы, содержащие ацетон), поскольку при последующем промывании колонки этим буфером он будет стремиться вытеснить вверх последние порции образца и эти порции будут медленно просачиваться в гель уже после того, как весь остальной образец войдет в гель. Аппликатор следует испробовать с помощью окрашенного образца: если зона образца будет неравномерной, лучше нанести его вручную. Для этого аппликатор удаляют, дают буферу впитаться в поверхность геля, закрывают зажим на выходной трубке и затем аккуратно наносят образец с помощью пастеровской пипетки, давая ему проникнуть на 5—10 мм внутрь слоя геля, и в то же время перемещают пипетку по периметру колонки (рис. 5.11). Когда весь образец будет нанесен, зажим открывают и дают образцу впитаться в поверхность геля. Затем повторяют весь процесс, используя буфер (примерно тот же объем, что и объем образца), — дают ему войти в гель, добавляют еще немного бу-
Разделение в растворе
211
Рис. 5.11. Нанесение образца на поверхность гель-фильтрующей колонки вручную. Следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить ровную поверхность геля. А. Буферу дают полностью впитаться в гель, после чего закрывают кран. Б. Образец наносят на колонку с помощью пипетки; открывают кран. В. Дают образцу проникнуть в гель. Г. Образец полностью впитался в гель; закрывают кран. Д. Наносят буфер и открывают кран. Е. Дают буферу полностью впитаться в гель и закрывают кран. Ж. Наносят еще какой-то объем буфера и присоединяют к колонке аппликатор; мертвое пространство в верхней части колонки допустимо.
фера и присоединяют аппликатор для непрерывной подачи буфера.
Следует помнить, что фермент будет элюироваться с колонки в том буфере, который содержится в ней до начала гель-фильтрации. Поэтому неважно, в каком буфере образец наносится на колонку или элюируется с нее. Таким образом, если нужный фермент необходимо элюировать в каком-то особом и относительно дорогостоящем буфере, нет смысла тратить его зря. Перед тем как нанести образец, нужно промыть колонку объемом этого специального буфера, равным одному объему колонки. Затем проводят гель-фильтрацию, используя какой-либо обычный дешевый буферный раствор.
Гравитационная неустойчивость, возникающая в'ходе нанесения образца (см. рис. 5.4), особенно велика, когда используются очень плотные растворы, такие, как растворенные осадки, полученные при фракционировании сульфатом аммония. Это особенно трудная проблема в случае применения мягких гелей типа сефадекса G-200. При использовании современных материалов с жесткими зернами плотная поверхность хроматографического слоя позволяет предотвратить избыточное смешивание
14*
212
Глава 5
Четкая передняя. граница
Четкая задняя граница
Рис. 5.12. Схема, демонстрирующая, каким образом можно избежать гравитационной неустойчивости, показанной на рис. 5.5. Л. Плотный раствор образца наносят снизу колонки при восходящем потоке жидкости. Б. После того как весь образец нанесен, колонку переворачивают. В. Менее плотный ¦буфер следует за образцом — колонка промывается нисходящим потоком.
при наслаивании плотного раствора на менее плотный буфер. Тем не менее более высокое разрешение (за счет того, что зона разделяемых веществ образует очень тонкий и плотный слой) получается, если образец наносят снизу колонки при восходящем потоке жидкости, а затем переворачивают колонку так, что •менее плотные слои буфера оказываются под поверхностью геля (рис. 5.12). Это не всегда удобно делать, но стоит попробовать, если разрешение хуже, чем ожидалось.
