Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
204
Глава 5
.Плотный раствор образца
Плотный раствор образца Б
Рис. 5.4. Гравитационные эффекты на границе между буфером и образцом при нанесении образца на гель-фильт-рующую колонку [291. А, Плотный раствор образца движется вниз между гранулами, создавая диффузный
фронт. Б. Плотный раствор образца, нанесенный снизу в восходящем токе жидкости, сохраняет резкий фронт.
©нная неустойчивость на переднем крае белковой зоны может •быть устранена, если поток элюента направить вверх против •сил гравитации, однако при этом нарушится гравитационная устойчивость на задней границе белковой зоны. Полностью эту проблему можно решить только при отсутствии гравитации. С турбулентностью нельзя бороться, не уменьшая скорости потока, но это лишь частично снимает проблему. При значительны уменьшении скорости потока не только недопустимо снижается скорость разделения, но и возрастают эффекты молекулярной диффузии, которые могут превзойти эффекты турбулентности.
Оба этих отклонения от идеального поведения можно сделать менее значительными, если использовать более мелкие транулы, что приводит к уменьшению расстояний, в пределах которых происходят отклонения. Поэтому более «тонкие» фрак-
Рис. 5.5. Турбулентный поток при гель-фильтрации приводит к большему размыванию белковых зон, чем только одна диффузия.
Разделении в растворе
205
ции гранул будут давать лучшее разрешение. Кроме того, использование более мелких гранул означает, что равновесие между их наружным и внутренним объемами будет устанавливаться быстрее, так как расстояния, на которые должны диффундировать молекулы, уменьшаются, и поэтому можно исполь-'зовать достаточно большие скорости потока без нарушения условий равновесия. К сожалению, чем мельче гранулы, тем выше должно быть давление, чтобы преодолеть сопротивление потоку, что в случае нежестких гранул приводит к их разрушению и закупорке колонки.
В последнее время разработка новых материалов и методов с целью добиться хорошего разрешения идет в двух направлениях. С одной стороны, увеличение жесткости гранул позволяет Использовать частицы меньших размеров (например, сефакрил S-200, 40—105 мкм вместо сефадекса G-150, 120—140 мкм) и достигать значительно больших скоростей потока вплоть до 'предельных, при которых за время прохождения белка по колонке равновесие не успевает установиться. Еще более мелкие гранулы требуют более высоких давлений, которых трудно достичь при рутинной работе. С другой стороны, развитие жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) дает возможность использовать очень мелкие частицы (например, 5— 10 мкм) обычно на основе силикатов, что обеспечивает высокое разрешение за очень короткое время. Однако ЖХВД — это преимущественно аналитический метод. Поэтому для разделения образца, количество которого превышает несколько миллиграммов, колонка необходимых размеров потребует снижения давления. По-видимому, эти два подхода дадут нечто среднее — жидкостную хроматографию при умеренном давлении с использованием очень тонких гранул и не слишком больших скоростей потока.
Выпущенные фирмой LKB новые «голубые колонки» предназначались для использования их при высоком давлении, однако было найдено (см. брошюры фирмы LKB), что низкие давления в сочетании с медленными скоростями потока дают значительно лучшее разделение. Главное достоинство этого материала, по-видимому, заключается в том, что он характеризуется очень широким интервалом фракционирования. В заданном диапазоне молекулярных масс разрешение лишь немногим лучше, чем то, которое достигается с помощью ультрагеля или се-факрила, имеющих более узкий интервал фракционирования. Вместе с тем существующие колонки для хроматографии белков •с помощью ЖХВД могут быть использованы для разделения нескольких миллиграммов и дают превосходные результаты на заключительных стадиях очистки белков, когда белок составляет лишь небольшую долю количества исходного материала.
206
Глава 5
Общие методические вопросы
Для начинающего исследователя гель-фильтрация открывает значительно меньше возможностей, чем ионообменная хроматография. До известного предела используемый буфер не должен влиять на достигаемую степень разрешения и единственная важная переменная — это тип материала, т. е. интервал эффективного фракционирования, для которого предназначен данный материал. Предположим, что в распоряжении исследователя имеются два-три поперечно-сшитых декстрановых или агарозных геля (сефакрил, ультрагель), с которыми легко работать, и сразу же возникает вопрос — какой гель выбрать и каковы должны быть размеры колонки. Образец наносится в небольшом объеме, поскольку объем каждого белкового компонента будет увеличиваться из-за обсуждавшихся выше эффектов, связанных с диффузией и неидеальностью потока. Так как эффективный объем фракционирования составляет приблизительно половину объема колонки, четкость разделения обусловлена тем, что образец наносится в малом объеме, который не должен превышать 3% общего объема колонки. Если объем еще меньше (вплоть до 1% общего объема колонки), то разделение получается несколько лучше. При объемах ниже 1% диффузия и
