Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение в растворе
225
билизованный лиганд замедляет движение фермента в электрофоретическом канале. Этот способ пригоден также для изучения и измерения констант взаимодействия. Наиболее крупные успехи были достигнуты при использовании иммобилизованных лектинов для разделения гликопротеинов i[141 ] и иммобилизованного цибакрона голубого (см. разд. 4.1) для выделения дегидрогеназ [1421. В недавно появившемся обзоре по этому вопросу ([ 143] суммированы трудности и возможные направления развития этого метода.
Обычный электрофорез основан на разделении белков по их подвижности при данном значении pH. Изоэлектрическое фокусирование заключается в том, что создается система с градиентом pH и белки, движущиеся в электрическом поле, достигают в этой системе такой области, в которой значение pH равно их изоэлектрической точке (рис. 5.20). Чтобы создать градиент pH, используют полимерные буферные вещества, которые сами напоминают белки в том отношении, что содержат большое число положительных и отрицательных зарядов и имеют изоэлектрические точки в той же области pH. Эти буферные вещества называются амфолитами. Они так же, как и белки, мигрируют в соответствии с их изоэлектрическими точками и,
5.3. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ И ИЗОТАХОФОРЕЗ
Буфер с высоким
4*
Буфер с низким*
pH
pH
К моменту завершения фокусирования
Рис. 5.20, Принципы изоэлектрического фокусирования. 15—1078
226
Глава 5
поскольку в смеси присутствуют сотни и даже тысячи различ-ных типов амфолитов, они распределяются вдоль всего блока (или колонки) между местом его соединения с катодом (слабо проводящие основания) и контактом с анодом (слабые кислоты). Таким образом, через несколько часов после наложения электрического поля амфолиты распределяются так, что возникает градиент pH. Интервал значений pH зависит от состава амфолитов (т. е. от интервала значений изоэлектрических точек самих амфолитов). Присутствующие в смеси белки также мигрируют, но, поскольку они обычно больше по размеру, чем амфолиты, требуется больше времени для того, чтобы они достигли положения изоэлектрического равновесия.
Высокая степень разрешения этого метода обусловлена одним важным преимуществом его по сравнению с другими разновидностями электрофореза. Это преимущество отражено в термине «фокусирование». В других методах разделения белков (за исключением изотахофореза — см. ниже) диффузия и перемешивание зон белка возрастают во времени. При изоэлектри-ческом фокусировании диффузия ограниченна, потому что, как только белковая молекула диффундирует и попадает в зону, отличающуюся по значению pH от ее изоэлектрической точки» она становится заряженной и мигрирует в обратном направлении. По завершении фокусирования теоретически ни один компонент системы не должен двигаться, и потому ток не может проходить (других ионов в системе нет). Следовательно, наложение сильных электрических полей должно приводить лишь к незначительному нагреванию, причем фокусирование будет осуществляться очень быстро. На самом деле слабый ток все же идет, и, если использованное напряжение слишком велико, градиент может исказиться и стать менее четко выраженным.
Изоэлектрическое фокусирование (электрофокусирование) вначале было предложено как препаративный метод. Однако оно получило более широкое распространение как аналитический прием (см. гл. 9). Хотя теоретически, а часто и на практике изоэлектрическое фокусирование — превосходный метод, некоторые связанные с ним трудности ограничивают его применение. Во-первых, это касается конструкции прибора. Изоэлектрическое фокусирование предъявляет менее жесткие требования в этом отношении, чем обычный электрофорез, благодаря почти полному отсутствию тепловыделения. Был разработан целый ряд систем, и некоторые из них оказались удачными. Так, было предложено помещать образец вместе с амфо-литами в длинную гибкую трубку, которую можно накрутить в виде спирали на горизонтальную катушку. После разделения индивидуальные компоненты под действием силы тяжести собираются в нижних частях спирали, которая разрезается, и мате-
Разделение в растворе______________ 327
риал из каждого сегмента собирается отдельно (рис. 5.21). Электрофокусирование можно также проводить в горизонтальном блоке, используя, как и в случае обычного горизонтального электрофореза, стабилизаторы типа порошка сефадекса. Однако зоны концентрированного белка получаются при этом гравитационно неустойчивыми, поскольку они имеют большую плотность, чем окружающая их жидкость. Поэтому белок собирается на дне блока и нарушает распределение амфолитов. Простой прибор, использующий гравитационный эффект, основан на применении свободного раствора и рифленых пластинок (рис. 5.22), но этот метод не получил широкого распространения. Основной способ препаративного изоэлектрического фокусирования— это использование вертикальной колоночной системы в приборе, сконструированном для обычного электрофореза. Стабилизация колонки осуществляется, как правило, с помощью градиента сахарозы, но используются и другие способы. Однако мелкопористые гели в этом случае-непригодны, так как белки невозможно извлечь из таких гелей — они не выходят из колонки, а остаются в зонах, соответствующих их изо-электрическим точкам. В качестве стабилизирующей среды можно применять гель с очень крупными порами типа агарозы, если его легко извлечь из колонки, разрезать на диски и вымыть из них белки. Можно даже расплавить мягкий гель агарозы, если только белки стабильны при температуре около 45°С.
