Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 5.1* Среды для гель-фильтрации
Фирма и название геля
Код геля Тип геля Используемый ин
тервал фракцио
нирования для гло
булярных молекул
(мол. массы)
Р-2* Полиакриламид 100---1800
Р-4* 800---4000
Р-6" > 1000---6000
Р-10* > 1500---20 000
Р-30* > 2300---40 000
Р-60 » 3000---60 000
Р-100 5000---100 000
Р-150 * 15 000---150 000
Р-200 * 30 000---200 000
Р-300 » 60 000---400 000
А-0,5 m Агароза 1000---0,5-10е
А-1,5 m > 2000---1,5* 10е
А-5,0 m 4000---5- 10е
A-15m* » 60 000---15- 10е
А-50 m* > 200 000---50*10*
А-150 m* 1 *10®---150* 10е
АсА22 Агароза/полиак 60 000--- ЫО*
риламид
АсА34 То же 20000---400 000
АсА44', > > 12 000---1 300 000
АсА54 » > 6 000---70 000
А2* Агароза 120 000---20 *10*
А4* 55 000---9* 10®
А6* > 25 000---2,4-10*
G-10* Декстран 50---700
G-15* 50---1500
G-25* * 1000---5000
G-50 » 1500---30 000
G-75 » 3000---70 000
G-100 4000---150 000
G-150 » 5000---300 000
G-200 » 5000---600 000
6В Агароза 10 000---4* 10*
4В >¦ 60 000---20-10е
2В* 70 000---40* 10е
CL-6B Поперечно-сшитая ю 000---4-10«
агароза
CL-4B То же 60 000---20-10е
CL-2B* ты > 70 000---40-10е
S-200 Декстран/бисак- 5000---300 000
риламид
S-300 То же 10 000---800 000
S-400 » > 20 000---2-10е
S-500 » > Мультифермент-
ные комплексы
с мол. массой
S-1000* > > >10®
Bio-Rad
Биогели
1ЖВ
Ультрагели
LKB
Агарозы
Pharmacia
Сефадексы
Pharmacia
Сефарозы
Pharmacia Сефакрилы
* Эти материалы не идеально подходят для фракционирования белков.
Разделение в растворе
203
S-300, — либо двух или трех ультрагелей — АсА22—АсА34 и (или) АсА44. Для белков небольших размеров одинаково пригодны сефадекс G-75 (предпочтителен «тонкий»), ультрагель АсА54 и биогель Р-60. Для крупных белков лучше применять агарозные гели, такие, как сефароза 4В или CL-4B, биогель А-5,0т, ультрагели А4 или А6, а также недавно появившиеся сефакрилы S-400, S-500 и S-1000. Хотя последние и охватывают область, которая включает большинство «типичных» белков с мол. массами 50000—500000, они по своей разрешающей способности значительно уступают другим материалам с тем же интервалом фракционирования из-за того, что кажущиеся размеры их пор имеют относительно большой разброс. Это объясняется тем, что крупным порам присуща большая эластичность по сравнению с мелкими порами более «сшитых» гелей.
Независимо от величины и формы частиц материала, используемого при гель-фильтрации, определенные его параметры остаются постоянными. Для сферических гранул Vo всегда составляет от 30 до 35% общего объема колонки Vt в зависимости от плотности упаковки материала. Поэтому полезный диапазон объемов элюции для разделения белков лежит в пределах примерно 80% оставшегося объема {Vt—Ко), т. е. составляет около 55% Vt. Общий объем, доступный для жидкости, несколько меньше, чем общий объем колонки, так как твердый материал гелевой матрицы вместе с прочно связанной водой занимает некоторый конечный объем. Для колонки с общим объемом 100 см3 можно ожидать разделения белков в диапазоне объемов элюции 35—90 мл, причем наилучшее разрешение между пиками белков с различными молекулярными массами будет достигнуто при выходе из колонки 60 мл элюата. Фактическое разрешение зависит не только от указанных выше параметров, но и от степени диффузии и отклонений от идеального поведения белков в колонке. Белки имеют относительно низкие коэффициенты диффузии, однако на практике они диффундируют значительно быстрее, чем можно было бы ожидать исходя из теоретических соображений.
В идеальных условиях белковый фронт должен двигаться только благодаря молекулярной диффузии. В эксперименте же даже при использовании колонок, упакованных по-всем правилам, возникают два осложняющих обстоятельства. Во-первых, вследствие гравитационной неустойчивости более плотный раствор, движущийся за фронтом белка, оказывается впереди теоретической границы (рис. 5.4). Во-вторых, турбулентность потока, возникающая, когда жидкость продавливается через узкое пространство между гранулами в более широкие пустоты, вызывает дополнительную диффузию. Рис. 5.5 иллюстрирует образование турбулентного потока между гранулами. Гравитаци-
