Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 77

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 145 >> Следующая

Pharmacia Fine Chemicals AB publications (1979). Affinity chromatography: Principles and methods, Uppsala.
Pharmacia Fine Chemicals AB publications (1980). Ion exchange chromato-: graphy: Principles and methods, Uppsala.
Turkova J. (1978). Affinity chromatography, Elsevier, Amsterdam.
ГЛАВА 5
РАЗДЕЛЕНИЕ В РАСТВОРЕ
Методы, описанные в гл. 3 и 4, связаны с фазовыми изменениями. Белки переходят из жидкой фазы (т. е. из раствора^ в твердую (в осадок или на поверхность адсорбента) и обратно. Не все белки выдерживают жесткие условия, характерные для этих методов, существуют более мягкие способы разделения белков, которые при этом находятся в растворе в течение всей процедуры. Один из них — гель-фильтрация — относится к важнейшим методам, применяемым для очистки ферментов и других белков, и будет рассмотрен детально.
Другие методы, сгруппированные под общим названием «электрофоретические методы», распространены не столь широко по причинам, которые будут рассмотрены в разд. 5.2 и 5.3. Третий, мало используемый прием разделения веществ в растворе— фазовое распределение, — при котором белки могут перемещаться из одной жидкой фазы в другую, описан в разд. 5.4. В качестве общего метода разделение веществ в растворе играет важную роль как в научных исследованиях, так и в промышленной очистке ферментов и других белков.
5.1. ГЕЛЬ-ФИЛЫРАЦИЯ
Для этого метода было предложено несколько названий, в том числе и такие, как гель-проникающая хроматография и мо-лекулярно-ситовая хроматография. Однако термин гель-фильтрация в настоящее время настолько широко распространен и общепризнан, что будет использоваться и в данной книге. Вместе с тем следует отметить, что это название неудачно, так как используемый материал не обязательно должен представлять собой истинный гель, а происходящий процесс не является на самом деле фильтрацией.
Выпускаемые фирмой Pharmacia chemicals сефадексы — гели, полученные на основе декстрана, — впервые были введены в практику Поратом и Флодином '[125] и вскоре получили общее признание в качестве материалов для гель-фильтрации, с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в со-
198
Глава 5
/
Поверхность
гранулы
Молекулы белка
Рис. 5.1. Двумерное изображение пор в гель-фильтрующем материале, показывающее доступность различных участков геля для молекул разных размеров.
ответствии с их размерами. Эти поперечно-сшитые декстрано-вые шарики очень скоро нашли широкое применение как для разделения белков, так и для определения их молекулярных масс [126, 127]. С тех пор дальнейшее развитие метода и расширение сферы его применения в результате усовершенствования гелей позволили ускорить время операций и охватить больший диапазон молекулярных масс биополимеров. Основные принципы метода просты. Гель состоит из открытой попереч-но-сшитой трехмерной молекулярной сетки, сформированной в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок.
Поры внутри гранул имеют такие размеры, что некоторые из них недоступны для крупных молекул, тогда как более мелкие молекулы могут проникать во все поры. Недоступность пор обусловлена тем, что они или слишком узки для молекул, или если даже достаточно широки, то не имеют каналов, выходящих на поверхность гранул, — это показано на двумерной схеме, приведенной на рис. 5.1. Двумерное изображение не отражает истинной картины, поскольку поперечные сшивки, которые, казалось бы, препятствуют проникновению молекул внутрь частиц, могут быть обойдены при перемещении молекул в направлениях, выходящих из плоскости рисунка.
В настоящее время принято считать оптимальными такие условия потока, при которых все доступные поры заполнены
Разделение л раствора
199
Рис. 5.2. Простая диаграмма, иллюстрирующая принципы гель-фильтра* ции для разделения на колонке молекул разных размеров. Крупные молекулы исключаются из большей части доступного объема колонки и поэтому быстро движутся впереди «фронта растворителя».
молекулами проходящего по колонке белка. Таким образом, здесь действуют равновесные, а не кинетические эффекты. Материалы различных типов имеют какую-то определенную долю пор, доступных для макромолекул данного размера с вероятностью от 0 до 100%. Невозможно изготовить материал с порами только одного размера, что позволило бы получить очень узкий диапазон фракционирования. В самых лучших материалах для гель-фильтрации поры имеют размеры, обеспечиваюг щие 90%-ное исключение макромолекул, которые по своим размерам (объему) в 5—б раз превосходят макромолекулы, исключаемые лишь из 10% объема гранул. Это означает, что у 80% пор ширина, по-видимому, примерно в два раза больше линейных размеров сферических частиц.
Схемы, объясняющие теорию гель-фильтрации, достаточно ясны, но часто дают ложное представление о размерах молекул и гранул геля. Так, на рис. 5.2 схематически изображены принципы метода, но истинные соотношения размеров молекул и гранул геля лучше переданы на рис. 5.3. Гранулы носителя, величина которых превышает линейные размеры молекул в 103—104 раз, имеют в молекулярном масштабе ворсистую поверхность.
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed