Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 87

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 81 82 83 84 85 86 < 87 > 88 89 90 91 92 93 .. 145 >> Следующая

Ниже будут описаны две буферные системы для обычного электрофореза — «прерывистая» (неоднородная, или дискретная) и непрерывная (однородная). Последняя весьма проста: один и тот же буфер используется в процессе всего электрофореза, так что в электрофоретическом канале не происходит изменения состава буфера. Чтобы уменьшить потери напряжения на участках, соединяющих электроды с истинным электрофоретическим каналом, можно использовать буферные растворы большой концентрации (рис. 5.18, Л). Обычно применяют буферы с суммарной ионной силой порядка 0,05—0,15. Это — компромисс между низкой проводимостью, позволяющей применять высокое напряжение, но способствующий белок-белковым взаимодействиям, и системой с минимумом таких взаимодействий, но более высокой проводимостью, в результате чего возникает проблема нагрева. Нагрев можно уменьшить, снизив силу тока.
Разделение в растворе
22*
Используется такое большое число разных буферных систем,, что перечислять их здесь не имеет смысла. Для обычного гель-электрофореза в качестве непрерывной буферной системы часто применяют трис-борат с pH около 8 или несколько выше и 2-амино-2-метил-1,3-пропандиолглицинат, pH 9—9,5. Ионная, сила этих буферных смесей зависит от выбранного значения pH: при более высоких значениях pH требуемая концентрация основания может доходить до 0,2 М, поскольку большая его часть остается незаряженной и не вносит вклад в проводимость. Высокие значения pH обычно используются с тем, чтобы большинство белков мигрировало к аноду. Однако для особых целей применяется много буферных систем с низкими значениями pH.
Дискретные буферные системы, используемые в гель-электрофорезе, способствуют сужению зон белка. В большинстве-случаев они применяются в аналитических целях, но могут быть использованы и в препаративном электрофорезе. Принцип заключается в том, что между стартовыми буферными ионами и следующими за ними ионами, имеющими более низкую подвижность, создаются дискретные зоны Кольрауша (рис. 5.18, ?). На границе между этими двумя дискретными областями зопьг разделяемых веществ и буферных ионов самопроизвольно сужаются, что можно часто наблюдать по изменению коэффициента преломления, обусловленному резким изменением концентраций на этой границе. Причины, вызывающие сужение белковой зоны, заключаются в следующем: 1) снижение проводимости сразу же за линией раздела между двумя областями с разной подвижностью создает высокий локальный градиент потенциала; это заставляет «замыкающие» белковые молекулы мигрировать быстрее, так что в конце концов они догоняют основную полосу, и 2) более высокое значение pH сразу же позади указанной линии раздела приводит к такому же эффекту, который описан в п. 1).
К типичным дискретным буферным системам (дискретность которых обусловлена анионами) следует отнести фосфат- и цитрат-ионы, ион ЭДТА и хлорид-ион, играющие роль подвижных стартовых анионов, и следующие за ними анионы с низкой подвижностью, которые обычно представляют собой буферы типа ВН=В~+Н+. Низкая подвижность такого буфераг в известной степени обусловлена тем, что в каждый данный момент часть его молекул не заряжена. При pH 8—10 чаще всего используются борат-ионы или глицинат-ионы. В области pH 6—& с успехом применяются цвиттер-ионы типа морфолиноэтансуль-фоната (МЭС) или морфолинопропансульфоната (МОПС)
224
'Глава 5
Аффинный электрофорез
Как и другие аффинные методы, аффинный электрофорез основан на том, что поведение интересующего нас фермента изменяют путем введения специфического по отношению к нему лиганда. В данном случае под поведением понимается электрофоретическая подвижность. Существуют два возможных способа проведения такого электрофореза. Первый — включение заряженного лиганда в буфер, что приводит к повышению или снижению подвижности белка в зависимости от разницы между значениями его суммарного заряда в отсутствие и в присутствии лиганда. При препаративном электрофорезе в отсутствие лиганда происходит отделение группы белков с одинаковой средней подвижностью. Если подвергнуть такой образец повторному электрофорезу в присутствии лиганда, то нужный фермент должен отделиться от неспецифических белков (рис. 5.19). Однако это не более чем теоретические предпосылки.
Второй способ, который дает хорошие результаты, заключается в иммобилизации, или включении, лиганда в носитель для электрофореза, например в гель или стабилизирующий порошок, используемый в электрофоретическом канале. Этот способ аналогичен широко применяемому аналитическому методу «ракетного» иммуноэлектрофореза. Второй способ проведения ..аффинного электрофореза существует в нескольких вариантах [140—142], в том числе в препаративном; в этом случае иммо-
А
В присутствии лиганда
Объем элюции В
Рис. 5Л9. Принцип аффинного электрофореза первого типа (см. текст). Л. Без лиганда. Б. Фракция, содержащая фермент, подвергнута повторному электрофорезу в присутствии лиганда.
Предыдущая << 1 .. 81 82 83 84 85 86 < 87 > 88 89 90 91 92 93 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed