Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Поведение молекул в колонке при гель-фильтрации может быть описано несколькими способами. Его можно выразить следующим уравнением:
*ср = (Ve~V0)l(Vt-V0),
где Vt — общий объем колонки, У о — свободный объем (между гранулами геля), Ve — объем элюции рассматриваемой молеку-лы и /Сер — коэффициент, определяющий долю пор, которую может занимать эта молекула. Альтернативный подход состоит в том, что между объемом элюции неизвестного белка и объемом
200
‘Глава 5
Внутри гранулы
Между
гранулами
Внутри гранулы
Рис. 5.3. Масштабная диаграмма, иллюстрирующая относительные размеры молекул (зачернены) и гранул, используемых в гель^фильтрации.
элюции ряда молекул известных размеров устанавливают соотношение, из которого путем простой экстраполяции определяют размер неизвестной молекулы. Теоретически объем элюции связан не с размером молекулы, а с ее стоксовским радиусом. ¦Стоксовский радиус описывает сферу с гидродинамическим поведением, эквивалентным поведению данной конкретной частицы неправильной формы. Поэтому, допуская, что по своей форме неизвестные и калибровочные белки сходны, можно калибровать колонку по молекулярной массе.
Для очистки белков точное определение объема элюции не столь существенно при условии, что балластные белки хорошо отделяются. Обычно желательно, чтобы нужный белок элюировался в диапазоне, лежащем между одной третью и двумя третями общего объема колонки, так как именно в этой области достигается наивысшее разрешение. Однако для некоторых специальных целей приходится выбирать другую область объемов элюции (см. ниже).
Сефадекс (поперечно-сшитый декстран), который используется уже более 20 лет, будет и дальше использоваться, особенно при работе в промышленных масштабах, когда необходимо учитывать быстроту, стоимость и удобство выполнения операций. Поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели) также находят широкое применение и имеют сходные с се-фадексом интервалы фракционирования. Для очень больших молекул белков, вплоть до агрегатов, приближающихся по размерам к вирусам, наиболее предпочтительны агарозные гели. Попытки ввести в белковую химию материалы на основе стекла с контролируемым размером пор не увенчались успехом из-за сорбции белка на его поверхности. Хотя эти трудности можно было бы преодолеть, преимущества стеклянных гранул, обусловленные их жесткостью, в значительной степени утратили свою ценность вследствие появления новых, более совершенных материалов. Основная проблема, связанная с использованием сефадекса и полиакриламида, заключается в мягкости их гранул; даже очень слабое давление, в том числе осмотическое давление, возникающее в колонке во время хроматографиче-
Разделение в растворе
201
ского разделения, вызывает деформацию гранул, приводит к неравномерной упаковке материала и в конечном счете служит причиной плохих характеристик потока. Всех этих недостатков в основном лишены декстраны, содержащие дополнительные поперечные сшивки, образованные акриламидом. Этот материал, называемый сефакрилом (Pharmacia), дает более жесткие гранулы, с которыми можно оперировать при повышенном давлении и, следовательно, при более высокой скорости потока. Ультрагели (LKB) представляют собой агарозные гели с вкрапленными в них цепями акриламидного полимера, что придает им большую жесткость и меньшую nopnctocTb по сравнению с чистой агарозой. Они пригодны для разделения большинства белков и имеют сходные с сефакрилами S-200 и S-300 интервалы фракционирования. Агарозные гели, предназначенные для разделения очень крупных молекул, выпускают несколько фирм-изготовителей. Фирма Pharmacia предлагает наиболее жесткие поперечно-сшитые агарозы, такие, как CL-сефарозы, но даже они, вероятно, будут вытеснены новой продукцией той же фирмы — сефакрилами S-400, S-500 и S-1000. Список имеющих* ся в продаже материалов для гель-фильтрации приведем в табл. 5.1.
Здесь необходимо указать, что не все эти материалы полностью инертны. Отмечена сорбция отдельных белков в присутствии некоторых буферных растворов (этим можно воспользоваться как приемом для разделения белков). Частичная сорбция замедляет элюцию, и поэтому белок ведет себя так, как если бы его молекулы имели меньшие размеры, чем это есть на самом деле.
Иногда сорбция носит ионообменный характер, и в таком: случае ее можно избежать, применив буферные растворы с высокой ионной силой. Сорбция может быть также обусловлена гидрофобными взаимодействиями, и тогда высокая ионная сила будет только помехой. Сефакрилы, в которых поперечные сшивки образованы алифатическими цепями, особенно склонны» проявлять сорбционные свойства при высоких концентрациях солей и низких значениях pH. Поэтому фирмы-изготовители рекомендуют использовать буферные растворы с значениями рН> близкими к нейтральному.
При таком огромном выборе разнообразных материалов начинающий нуждается в совете относительно того, что покупать. Если есть уверенность, что интересующий исследователя фермент не имеет необычно низкой (<15 000) или необычно высокой (>106) молекулярной массы, то можно обойтись двумя-тре-мя видами материалов. Так как поперечно-сшитые декстраны или агарозные гели превосходны практически во всех отношениях, то достаточно будет либо двух сефакрилов — S-200 и
