Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Методы препаративного электрофореза
Горизонтальный электрофорез
Для успешного электрофореза необходим «канал», в котором происходит разделение. Он может представлять собой колонку (вертикальную), плоскую ванну или прямоугольный блок (горизонтальный), в которых движутся белки. Связь обоих концов этого «канала» с электродами осуществляется через большие резервуары с буфером. Необходима также система охлаждения, чтобы поддерживать постоянной температуру «канала». Из-за того что в свободном растворе трудно поддерживать устойчивую границу, буфер в этом канале может быть смешан с инертным порошком или материалом в виде гранул, что позволяет снизить до минимума как гравитационную, так и диффузионную нестабильность. Простейшая система представляет собой горизонтальный блок. Сухой порошок крахмала, сефадекс G-25 (не удерживающий белок) или порошок любого другого полимерного материала смешивают с буфером так, чтобы образовалась густая суспензия, которую вносят в прибор. Избыток буфера удаляют. Вместо суспензии можно использовать очень крупнопористый гель, например 2%-ный агар или агарозу. Концы геля соединяют с увлажняемой тканью или другим материалом, образующим контакт с наполненными буфером резервуарами, в которые помещены электроды (рис. 5.14).
Желобок дли образца
Лоток с анодным электродным буфером
Рис. 5.14. Горизонтальный препаративный электрофорез с порошком или ге лем агара в качестве стабилизатора.
218
Глава 5
Желобок для образца
Рис. 5.15. Электрофорез* в изоэлектрической точке. Нужный фермент неподвижен, тогда как белки с другими изо-электрическими точками движутся каждый в своем направлении.
В блоке геля прорезают вертикальную канавку и заполняют ее суспензией порошка в белковом растворе (предварительно уравновешенном в том же буфере). Затем включают ток и начинают электрофорез. Если прибор помещен в холодной комнате и поддерживается низкая сила тока, то достаточно охлаждения за счет естественной конвекции.
После проведения электрофореза блок разрезают на части и, обрабатывая каждую часть небольшим количеством буфера, вымывают белок. Таким методом обычно достигается не очень хорошее разрешение, как об этом уже говорилось выше, и оно* редко бывает лучше, чем при ионообменной хроматографии. Вместе с тем белки в данном случае все время остаются в растворе и потому в меньшей степени подвергаются вредным воздействиям.
Интересной разновидностью является электрофорез в изоэлектрической точке [133], который проводят, если ее значение известно для нужного фермента. Белковую смесь готовят в буфере при pH, соответствующем изоэлектрической точке этого фермента. Образец помещают в канавку, сделанную в агарозном геле, и начинают электрофорез. Фермент остается в канавке, тогда как загрязняющие белки движутся в обоих направлениях (рис. 5.15). Исходное требование — найти значение рН„ при котором фермент не будет двигаться. Оно может отличаться-от изоэлектрической точки, определенной методом нзоэлектри-ческого фокусирования (см. разд. 5.3). Изоэлектрическая точка часто зависит от используемого буфера из-за связывания белком буферных ионов. Связывание фосфат- и цитрат-ионов — это обычное явление, которое приводит к снижению изоэлектриче^ ской точки. При изоэлектрическом фокусировании проводится' аппроксимирование к нулевой концентрации буфера, и найден* ное при этом значение на самом деле представляет собой «изо-ионную точку», т. е. значение pH, при котором отсутствует свя^ зывание ионов с белковой молекулой.
ИЭТ, перемещаются
Разделение в растворе
219
Желобок для образца
I
+
111) in iBi))})
Электроэндоосмотический поток
Рис. 5.16. Влияние электроэндоосмоса на подвижность белков.
!
Белки с ИЭТ, равной pH буфера
Другой фактор, влияющий на реальную (но не теоретическую) подвижность, — это электроэндоосмотический ток, т. е. поток основной массы жидкого растворителя под влиянием электрического поля за счет иммобилизованных заряженных групп, присутствующих на стенках электрофоретической камеры и на поверхности любой стабилизирующей среды — порошка или геля.
Каждый ион ассоциирован с несколькими молекулами воды, которые мигрируют вместе с ним. Иммобилизованные анионы, такие, как карбоксилат-ионы на молекулах крахмала, не могут мигрировать, но ассоциированные с ними противоионы мигрируют. Будучи катионами, они перемещаются к катоду, что приводит к результирующему движению воды в этом направлении (суммарный результат переноса воды другими буферными ионами в обоих направлениях близок к нулю). В случае таких материалов, как крахмал и агар, электроэндоосмос может быть столь значительным, что многие компоненты будут мигрировать к катоду, несмотря на то что они имеют отрицательный заряд (рис. 5.16).
Ток жидкости к катоду происходит благодаря наличию иммобилизованных отрицательных зарядов (карбоксилат-, сульфат- и фосфат-ионов), обычных для биологических полимеров. Даже самая чистая агароза несет все же несколько отрицательных зарядов и электроэндоосмос может быть устранен лишь в том случае, если гель формируется в присутствии небольших количеств положительно заряженных полимеров типа ДЭАЭ-декстрана, нейтрализующих этот эффект. В препаративном электрофорезе электроэндоосмос не является слишком серьезной проблемой, поскольку здесь более важна не причина перемещения полосы белка, а достигаемое при этом отделение ее от других белковых компонентов смеси.
