Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
15*
228
Глава 5
---------- Градиент pH
собираются в изломах пластинки
Рис, 5.22. Изоэлектрическое фокусирование в рифленой пластинке [29].
Во-вторых, даже если имеется подходящий прибор, остается проблема, касающаяся свойств нужного фермента в изоэлект-рической точке и в меньшей степени свойств сопутствующих белков, присутствующих в препарате. Здесь важны два свойства: 1) фермент должен быть стабилен и 2) он должен быть растворим при нулевой ионной силе. Нельзя предполагать заранее наличие этих свойств у данного фермента. Большинство внутриклеточных ферментов сильно дестабилизируется в области кислых значений pH, и эта область может перекрывать их изоэлектрические точки. Так, если животный белок не может долго сохраняться при pH 6, а его изоэлектрическая точка равна 5,5 (не столь уж низкое значение), то при использовании изоэлектрического фокусирования он будет подвергаться воздействиям pH ниже 6,0 (сходные проблемы возникают при хро-матофокусировании — другом методе изоэлектрического фокусирования, см. разд. 4.3). Белки растений и микроорганизмов существуют в природе при более низких значениях pH (и, следовательно, более кислотоустойчивы), но часто они имеют и более низкие изоэлектрические точки, чем белки животных, поэтому в изоэлектрических точках они с равной вероятностью будут неустойчивыми.
Если белок достаточно стабилен при выбранных условиях, следует проанализировать его растворимость. Выпадение белка в осадок в зоне изоэлектрической точки будет нарушать электрическую проводимость в колонке, и осадок может просто осесть на дно. Однако приборы, подобные тому, который показан на рис. 5.22, работают даже лучше, если белок осаждается в его изоэлектрической точке. Следует подчеркнуть, что белок вряд ли будет осаждаться вблизи его изоэлектрической точки, а поскольку выпадение в осадок — явление, связанное с растворимостью, достаточно высокая концентрация белка, вызывающая его осаждение, вероятно, будет создаваться только в самой
Разделение в растворе
229
изоэлектрической точке. Конечно, если осаждается загрязняющий белок, то лучше, чтобы во всей системе существовали условия, препятствующие осаждению.
Основная причина, по которой препаративное изоэлектрическое фокусирование не получило широкого распространения, связана не с теоретическими трудностями, а с соображениями стоимости. Амфолиты, поставляемые фирмой LKB Products (Ampholines) или фирмой Pharmacia (Pharmalites), недешевы, и их частое применение при разработке метода очистки фермента может оказаться тяжелым бременем для бюджета лаборатории. Типичная колонка, на которую можно нанести 100^-200 мг белка, должна иметь объем 100 см3, при этом концентрация амфолита составляет 2—4% (вес/объем). Это общее количество необходимого амфолита, так как буферный раствор между колонкой и электродами не содержит амфолита. На анодном конце колонки используется слабая кислота типа НА=Н++А~; когда в результате диффузии эта кислота проникает в колонку, происходит ее ионизация вследствие того, что здесь она попадает в условия более высокого значения pH. Образовавшиеся анионы затем перемещаются обратно в процессе электрофореза, протоны же связываются амфолитом, который заряжается положительно и движется в более щелочную область. Здесь он быстро вновь нейтрализуется, отдавая протоны следующему амфолиту. Таким образом возникает слабый ток, и протоны перемещаются от анода к катоду. Точно так же гидроксил-ионы могут двигаться от катода к аноду. Относительный вклад обоих этих ионных потоков в суммарный стационарный ток зависит от области pH используемых амфолитов и от значения р/Са кислоты и основания, присутствующих на обоих концах колонки. В продаже имеются амфолиты с узким и широким интервалами значений pH, и если достаточно точно известна изоэлектрическая точка данного фермента, то следует сначала попробовать амфолиты с узкой областью pH (например, до 2 единиц pH).
Вследствие эффекта фокусирования образец можно вводить в любую точку колонки или даже смешивать с амфолитным буфером при наполнении колонки. Однако последний прием обычно не рекомендуется, так как контакт белка с весьма низкими или высокими значениями pH на концах колонки может привести к его денатурации и осаждению. Обычно верхняя часть колонки служит катодным концом, и образец удобно вводить именно в этом месте (денатурация и осаждение белка в щелочных условиях менее вероятны, чем в кислых), затем на него наслаивают небольшое количество амфолита, перед тем как в эту часть колонки вводят катодный буфер. Следует соблюдать правильную последовательность в наслаивании раство-
230
(Глава 5
К катоду
Л
Буфер
Амфолит____
Образец------'Щ//,
Г радиент плотности сахарозы
Высота слоя в колонке
+
Амфолит
К аноду
Концентрации сахарозы рованная
Рис. 5.23. Колонка для изоэлектрического фокусирования, стабилизированная градиентом плотности сахарозы.
ров с разной плотностью. Содержащийся в образце белок будет увеличивать плотность раствора, поэтому к нему следует добавлять меньше сахарозы (рис. 5.23). Даже если стабилизирующая система состоит из порошка, то и в этом случае необходимо в какой-то степени учитывать плотности соответствующих растворов. Добавление сахарозы не повредит системе, при условии что в смеси нет ферментов, катализирующих превращение сахарозы. Как и в случае простого электрофореза, описано множество разных приборов, имеющих каждый свои характеристики и особенности конструкции.
