Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
160000 дальтон и заряд —10. Тем не менее на практике при
электрофорезе в свободном растворе первые два белка вряд ли будут разделены. Это связано с техническими трудностями создания устойчивой границы между раствором белка и буфером, а также с тем, что в типичном эксперименте происходит значительная диффузия. Электрофорез с подвижной границей (метод Тизелиуса), используемый в качестве аналитической системы, редко позволяет различить более восьми компонентов даже при разделении очень сложных смесей, что обусловлено диффузией,
Разделение в растворе
215
приводящей к перекрыванию белковых зон, а иногдаI и белок-^белковыми взаимодействиями. Взаимодействия между разными ^белками при низкой ионной силе могут быть нескольких типов. Для многих белков, относящихся к альбуминам, т. е. для хорошо растворимых белков, наибольшее значение имеют электростатические взаимодействия. Эти взаимодействия можно свести гК минимуму, увеличив ионную силу (см. обсуждение методов всаливания в разд. 3.2 и элюции солевыми растворами с ионообменников в разд. 4,2), но повышение ионной силы увеличивает силу тока при электрофорезе, что ведет к сильному нагреву смеси.
Важнейшая проблема при конструировании приборов для препаративного электрофореза — это необходимость эффективного отвода тепла, с тем чтобы все части системы находились при постоянной температуре. Поэтому приходится идти на компромисс между желанием ослабить белок-белковые взаимодействия путем повышения концентрации соли и стремлением уменьшить тепловыделение путем понижения концентрации соли. Все присутствующие в системе соли обычно входят в состав буфера (при этом нет никакой необходимости использовать сильные буферы, если продукты электролиза отделены от белков). Можно применять буферные смеси с низкой проводимостью, в которых ионные компоненты имеют относительно большие размеры и низкую электрофоретическую подвижность, например Н-трис+. В составе буфера эти ионы еще менее подвижны, поскольку часть времени они находятся в незаряженном состоянии, например борат~ч=±Н-борат. Поэтому трис-бо-ратный буфер с pH 8—9 — один из самых популярных буферов для электрофореза. При pH 7—8 в качестве буфера с низкой проводимостью рекомендуется трис-МОПС (МОПС — морфоли-нопропансульфонат). Электрофорез обычно проводят при нейтральных или слабощелочных pH, когда большинство белков мигрирует к аноду.
С помощью гель-электрофореза молекулы, имеющие в иных условиях близкие электрофоретические подвижности, разделяются по их размерам. Первоначально для этой цели использовали крахмальный гель [128], который и до сих пор применяется в аналитических целях. Однако крахмальный гель никогда не удавалось успешно использовать в препаративных масштабах. Универсальным средством для анализа белков (а теперь и нуклеиновых кислот) в биохимических лабораториях стал полиакриламидный гель [129]. Он также пригоден и для препаративного электрофореза. Поскольку этот гель, представляющий собой трехмерную сетку нитей, образующих поры разных размеров [130], обладает разной эффективной вязкостью в зависимости от размеров молекул, уравнение (5.2) для электро-
216
Глава 5
60
4,2 4,4 ' 4,6 4,3
Логарифм молекулярной массы
5,0
Рис. 5.13. Зависимость электрофоретической подвижности от молекулярной массы белковых молекул сходной формы и одинаковой плотности заряда. Все молекулы очень малых размеров имеют одинаковую подвижность из-за того, что гель оказывает им недостаточное сопротивление, обусловленное его вязкостью.
форетической подвижности и=г/&лцг усложняется. В области «молекулярно-ситового распределения» подвижность линейно связана с логарифмом молекулярной массы для всех веществ, имеющих молекулы сходной формы [131], так что в присутствии додецилсульфата натрия (разд. 9.1) [132] и=ио(А—lg мол. масса)/Л, где А — логарифм молекулярной массы, линейно экстраполированной к нулевой подвижности (рис. 5.13). Так как и0 — подвижность малой молекулы, не взаимодействующей с гелем, — равна z/6nr\r, то
и величину Лт]/(Л—lg мол. масса) можно рассматривать как эффективную вязкость в среднем диапазоне молекулярных масс.
Разделение при гель-электрофорезе происходит как по зарядам, так и по размерам молекул. Гель можно приготовить таким образом, чтобы он имел размеры пор, подходящие для данной группы разделяемых белков. Важнейшее преимущество гелей— это их стабилизирующее действие, проявляющееся в снижении до минимума конвекционной и диффузионной подвижности белков. Поэтому белковая полоса остается узкой все время, пока белок движется через гель, и это приводит к тому, что до-
6ЛТ|Г
А — lg мол. масса А
Разделение в растворе
217
стигается полное разделение белков с очень близкой подвижностью. Этот эффект еще будет обсуждаться в гл. 9. Для аналитических целей гели превосходны. Что же касается препаративных методов, то здесь, несмотря на то что гели обладают потенциально ценными свойствами, при работе с ними возникает множество серьезных проблем.
