Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
290
Глава 8
Измерение количества продукта
Нет никаких ограничений в выборе метода, с помощью которого можно измерить количество продукта, если при остановке реакции в инкубационную смесь не внесены какие-то ве-.щества, мешающие таким измерениям. Методы, применяемые для измерения продуктов реакции, можно разделить на три основные группы — энзиматические, химические и радиохимические методы.
В энзиматических методах используются очищенные ферменты, под действием которых продукт прямо или косвенно превращается в соединение, количество которого поддается измерению. Чаще всего применяются спектрофотометрические и флуориметрические методы, однако есть и много других способов (например, биолюминесценция, образование газообразных соединений). При использовании того или иного энзиматического метода его обычно приспосабливают к непрерывным,
о_
ч
1-
*
>
Отбор пробы для определения [Р]
S' Остановка реакции
о
*
Время Первая инкубация
S------ Р
Реакция,
поддающаяся
наблюдению
АН = [Р]
±
Т
Время
Рис. 8.5. Схема измерения ферментативной активности с помощью периодического метода и последующею определения продуктов реакции ферментативным путем.
Измерение активности ферментов
29!
а не периодическим способам регистрации. Но иногда периодические способы оказываются более удобными, более точными или более дешевыми. Поскольку ферменты обладают специфичностью по отношению к субстратам, в данном случае не возникает необходимости отделять продукты от реактантов. Продукт подвергают действию одного или нескольких ферментов и реакцию стараются довести до конца. Так как активности добавляемых ферментов не нужно «согласовывать» с активностью определяемого фермента, как это делается в непрерывных методах (ср. разд. 8.3), можно использовать значительно меньшие количества ферментов, с тем чтобы реакция могла спокойно продолжаться от 10 мин до 1 ч если это необходимо. Для энзиматического анализа метаболитов требуются такие количества фермента, которых достаточно для практически полного завершения реакции за приемлемое время. Можно показать, что для 98—99%-ного завершения реакции за 10 мин минимальное количество единиц фермента в одном миллилитре раствора (V'max) определяется уравнением Утах1Км = \ мин-1 [168], где Км — константа Михаэлиса для сопрягающего фермента по отношению к соответствующему субстрату. Методика измерений схематически показана на рис. 8.5.
В качестве примера рассмотрим определение фруктозо-бис-фосфатазы в присутствии Pi.
Первая инкубация:
Образец + фруктозо-1,б-бисфосфат+PiH-активаторы, инги-
биторы и т. д.
Остановка реакции
Измерение количества фруктозо-6-фосфата (Р на рис. 8.5)
Ер — фосфоглюкозоизомераза
Eq — глюкoзo-6-фocфaтдeгидpoгeнaзa+NAD(P)+
Так как /См для ЕР по отношению к фруктозо.-6-Р равно 0,2 мМ, необходимо, чтобы количество фермента удовлетворяло по крайней мере следующему равенству: Ктахр = 0,2х 1 =0,2 ед. X Хмл-1. Поскольку первая реакция обратима, следует взять несколько больше фермента, например 0,5 ед.-мл-1.
Если /См для Eq по отношению к глюкозо-6-Р составляет 0Л мМ, фермента нужно не менее V'maxQ = 0,IXl =0,1 ед.-мл-1. Из-за того что второй фермент может не быть насыщенным: NADP+, лучше взять вдвое больше фермента—0,2 ед.-мл-1.
Фруктоэо-6-Р-----
Глюкозо-6-Р — 6-Р-гпюконат
NADP+ NADPH Намерение А340
292
Глава 8
Определение фруктозо-бисфосфатазы можно проводить и в
непрерывном режиме, однако в этом случае следует брать по крайней мере в 5 раз больше сопрягающих ферментов (см. разд. 8.3).
Нельзя дать общих рекомендаций по определению продукта Р, так как для этого используются самые разные способы. Если невозможно измерить Р в присутствии остаточных количеств субстрата S (из-за того, что оба имеют сходную структуру), возникает необходимость в использовании методов разделения. Разделение всегда требуется, если применяются радиохимические методы, которые будут обсуждаться ниже. Если же разделения не требуется, химические реактивы можно добавлять прямо в раствор после остановки реакции, причем часто без предварительной нейтрализации этого раствора (в тех случаях, когда для остановки реакции используется подкисление). Как указывалось выше, при денатурации белков додецилсуль-фатом натрия не происходит образования белкового осадка. Поэтому удобно, например, измерять содержание фосфата, останавливая реакцию додецилсульфатом натрия и добавляя затем не осаждающий белки кислый молибдатный реактив (вместо обычно применяемой надхлорной кислоты в этом случае используют серную). Додецилсульфат натрия не влияет на образование фосфатсодержащих окрашенных продуктов, и белок не выпадает в осадок.
