Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Накопление продукта может приводить к ингибированию1* реакции
Условия ограничены требованиями, предъявляемыми сопрягающей системой
Обычно требуются большие количества реактивов, однако использование микрокювет позволяет сократить их расходование.
Чувствительность обычно меньше, чем в случае радиохимических методов
Непрерывное наблюдение позволяет выявить нелинейность
Результаты получают сразу
Простые манипуляции
Необходимы сопрягающие ферменты, они могут дорого стоить и (или) содержать примеси
Продукт удаляется с помощью сопрягающей системы
]) Для удаления продуктов можно ввести сопрягающую систему, которая не мешает наблюдениям.
306
Глава 8
отвечают: «За изменением поглощения при 340 нм». Далее можно задать следующие вопросы: «Происходит ли это изменение вследствие изменения мутности раствора или благодаря изменению концентрации NADH?, «Что еще может приводить к снижению или повышению концентрации NADH?» и т. д. Такие проблемы, как превращение субстрата под действием другого фермента или расходование продукта вследствие побочных реакций, могут быть разрешены с помощью различных контрольных определений, а иногда ингибиторов. Это обсуждается более подробно в работе [167].
Изложив принципы периодических и непрерывных способов определения ферментов, можно сравнить их относительные преимущества и недостатки. Это уже частично было сделано выше; в табл. 8.3 дано систематическое их сопоставление. В заключение необходимо упомянуть о так называемом «непрерывно-периодическом» методе. Используя автоматическую систему тестирования ферментов, можно отбирать пробы из реакционной смеси и после остановки в них реакции измерять количество продуктов реакции, получая таким образом непрерывный ряд значений ферментативной активности. Пример, приведенный на рис. 8.13, показывает, каким образом этот метод применяется для тестирования фосфатобразующих ферментов. Таким же способом можно проводить множество других определений, которые раньше выполнялись только с помощью периодических методов.
Дозирующий насос
спектрофотометра
Рис. 8.13. Схема «непрерывно-периодического» определения ферментативной активности путем измерения продукта реакции — фосфата. Из реакционной смеси непрерывно отбираются пробы, к иим добавляется реактив на фосфат, и регистрируется образование фосфата.
Измерение активности ферментов
307
8.4. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ФЕРМЕНТОВ
Выше были кратко описаны теория и основные принципы измерения ферментативной активности, причем были даны многочисленные рекомендации относительно того, что следует и чего не следует делать. Этот короткий раздел касается практических аспектов проведения измерений в лаборатории.
За обычный рабочий день, когда идет очистка фермента, иногда проводят лишь одно или два, но чаще десять или двадцать измерений активности, а во время элюции их может понадобиться еще больше. Многие смеси для тестирования ферментов содержат целый ряд компонентов — буферы, соли, субстраты, кофакторы и т. д.; поэтому приготовление отдельно каждой смеси не только неудобно, но и плохо в том отношении, что вследствие небольших изменений и ошибок в процессе приготовления состав смеси каждый раз будет меняться. Луч* ше всего подсчитать, сколько смеси расходуется за день, и приготовить весь необходимый объем сразу, исключив из него субстрат, который добавляют в последний момент при каждом определении. Некоторые реактивы, например простые буферные и солевые растворы, можно смешивать и хранить (охлажденными) в течение нескольких недель. Таким образом можно приготовить «реактив А», включающий все компоненты буфера, соли и, возможно, кофакторы; чтобы получить полную смесь, в него нужно добавить лишь один или два компонента. Многие биохимические реактивы весьма устойчивы в незамороженных растворах, при условии что исключено бактериальное или грибковое заражение. Для этого обычно достаточно добавить одну каплю 20%-ного раствора азида натрия на каждые 20 мл раствора. Многие исходные концентрированные растворы можно хранить при этом в течение нескольких месяцев в холодильнике. Другие реактивы могут быть химически неустойчивыми, и поэтому их надо приготавливать каждый день заново. Азид натрия редко влияет на ферменты, и, во всяком случае, он сильно разбавляется, если исходные растворы реактивов были концентрированными. В качестве примера приведем протокол смешивания реактивов для определения гексокиназы.
Чтобы приготовить 20 мл «реактива А> для определения гексокиназы,
возьмите 2 мл исходного буфера с pH 8,0 (см. ниже),
добавьте 1—2 капли 5%-него раствора бычьего сывороточного альбумина,
0,4 мл исходного 10 мМ раствора NADP+,
0,4 мл исходного 50 мМ раствора АТР,
308
Глава 8
10 мкл глюкозо-6-Р-дегидрогеназы (суспензия в растворе сульфата аммония с активностью 1000 ед.*,мл-1).
Доведите объем раствора до 20 мл водой.
Исходный буфер содержит 0,3 М трис, 0,5 М КС1, 30 мМ MgS04, il мМ ЭДТА (+азид), pH доводят до 8 раствором НС1.
