Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Возможно также, что препарат субстрата содержит ингибитор. Если это конкурентный ингибитор (что бывает чаще всего), то к сожалению, он обнаруживается только при сравнении данного препарата с другим, лучше очищенным препаратом. Математически эту ситуацию можно описать следующим образом.
Для конкурентного ингибирования
где v — наблюдаемая скорость, 5 — концентрация субстрата, i — концентрация ингибитора, Ki — константа диссоциации фер-мент-ингибиторного комплекса.
Если ингибитор присутствует ,в субстрате, то iocs и
-%^1+4^+р,
где р — некая константа.
Если s имеет бесконечно большое значение, то Kmax/u= I+fJ, т. е. оба определяемых параметра Ушах и Км будут меньше, чем истинные значения, на множитель 1/(1 +'Р). Однако гиперболическая кинетика будет сохраняться (рис. 8.3).
В случае смешанного неконкурентного ингибирования
'Лиах t ] Ам г * | /См i
V ~ ' S "Т" Ki S ¦ Ki' ’
Измерение активности ферментов
283
Phj. 8.3. Л. Влияние конкурентного ингибитора, содержащегося в препарате субстрата, на скорость реакции. Слева — график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата; справа — график зависимости обратных величин. Б. То же, что и на рис. Ау но с неконкурентным ингибитором, содержащимся в субстрате.
где Ki —константа диссоциации комплекса фермент — субстрат — ингибитор.
Учитывая, что i пропорциональна 5, получаем
JW = 1 -f-ocs-f-6.
V s
Следовательно, график зависимости llfv от 1/s будет нелинейным, и в ходе реакции будет наблюдаться кажущееся субстратное ингибирование (рис. 8.3).
Примером конкурентного ингибитора, остававшегося в течение долгого времени невыявленным, может служить примесь алюминия в продажных препаратах АТР, из-за 'которой, как было недавно обнаружено, уровень активности дрожжевой гек-сокиназы варьирует от препарата к препарату [166]. Комплекс А1—АТР является эффективным конкурентным ингибитором {/(г~0,1 мкМ), но кинетическая кривая все же сохраняет форму гиперболы: для АТР уменьшаются как Vmax, так и Км. Присутствие неконкурентных ингибиторов можно обнаружить, как
284
Глава 8
это показано выше. Такими ингибиторами могут быть соли, нежелательные ионы металлов, органический растворитель, в котором растворен субстрат, а также, возможно, какие-то другие, трудно выявляемые вещества.
В заключение следует подчеркнуть, что существует ряд трудностей при выборе подходящей концентрации субстрата. Ради экономии иногда можно отступить от соблюдения идеальных условий. Во всяком случае, серийные определения не обязательно должны быть абсолютно верными и точными.
Влияние pH, ионной силы и температуры
Установив, что концентрация субстрата должна быть по возможности не менее чем в 10 раз больше Км, необходимо указать на зависимость /См от других факторов, таких, как pH, ионная сила и температура. Эти параметры влияют также и на каталитическую константу скорости kK!n(Ктах=/гкатХобщая концентрация фермента). Хотя оптимум pH определяют как значение pH (или интервал значений pH), при котором достигается максимальная активность (максимальная величина Ушах), снижение активности при изменении pH может быть обусловлено резким возрастанием величины Км (и, следовательно, снижением степени насыщения фермента субстратом), а не уменьшением Vmax. Некоторые ферменты при измерении их активности в присутствии высоких концентраций субстрата имеют оптимум pH, сильно отличающийся от физиологического. Например, щелочные фосфатазы, как показывает их название, проявляют максимальную активность в щелочной области pH (10—11), хотя в условиях in vivo они функционируют при pH около 7. Причина заключается в том, что в физиологическом отношении величина Км гораздо важнее, чем величина Wax; в клетке субстраты присутствуют всегда в очень низких концентрациях. Поэтому в данном случае значение Км при pH 7 намного меньше, чем при pH 10.
Это отступление призвано подчеркнуть необходимость очень осторожного определения «оптимального pH». Для энзимолога оптимум pH —это тот pH, при котором k^(Vmsyi имеет наивысшее численное значение, т. е. для него это — величина, независимая от концентрации субстрата. Все эти тонкости несущественны для получения воспроизводимых результатов при определении активности фермента в ходе его очистки. Используя достаточно высокую концентрацию субстрата, можно определить скорости реакции в каком-то интервале значений pH и найти оптимальное значение v (не обязательно Vm&x). При этом очень важна природа буфера, так как многие компоненты буферных растворов изменяют поведение фермента, действуя прямо или
Измерение активности ферментов
285
косвенно как ингибиторы. Фосфат или другие многозарядные анионные буферные соединения, такие, как цитрат, могут конкурировать с отрицательно заряженным субстратом, непрочно связываясь с положительно заряженным активным центром фермента. Так как используемые концентрации буфера обычно составляют 10—100 мМ, даже слабая ассоциация ионов с активным центром будет приводить к значительному ингибированию реакции. Важные для активности фермента ионы металлов могут образовывать комплексы с компонентами буфера. Особенно эффективными комплексообразователями являются цитрат и гистидин. Наконец, на активность фермента влияет ионная сила буфера и других содержащихся в растворе солей. Физиологически нормальная ионная сила составляет 0,1—0,2 М. При более низких значениях ионной силы активность ферментов обычно не снижается, однако концентрации соли выше 0,2 М часто подавляют их активность. Поэтому, определяя ферментативную активность в надосадочной жидкости после осаждения сульфатом аммония, не следует брать больших аликвот, если только не установлено, что эта соль не оказывает на фермент ингибирующего действия.
