Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Наконец, необходимо учитывать и температуру, при которой проводится определение. Не существует такого понятия, как оптимальная температура действия фермента; есть лишь оптимальная температура для данного метода тестирования. Скорость ферментативной реакции, как и почти любого другого химического процесса, повышается обычно в 1,5—2,2 раза с повышением температуры на 10 °С (среднее значение 1,8). Однако за то время, которое необходимо для определения ферментативной активности, часть фермента будет потеряна в результате денатурации белка, происходящей при высокой температуре, так что повышение температуры приведет в конечном счете к снижению скорости образования продукта. Чем короче время инкубации, тем выше будет кажущийся температурный оптимум, так как при этом меньше белка успеет денатурировать. Типичные кажущиеся оптимумы температуры для определений, занимающих 5—10 мин, составляют 40—60 °С. Гораздо более высокие величины получены для ферментов, выделенных из термофильных микроорганизмов.
Для рутинного тестирования ферментов (за исключением упомянутых выше термофильных ферментов) неудобно и физиологически неоправданно использовать высокие температуры. Более того, желательна определенная стандартизация температуры, при которой проводится определение активности. В химии стандартной температурой долгое время считалась температура 25 °С (298 °К), и сначала эта температура рекомендовалась и для определения ферментов. Однако исследователи, работа-
286
Глава 8
ющие в тропических районах земного шара (а во времена, предшествовавшие нефтяному кризису, и исследователи США), жаловались, что температура в их лабораториях обычно выше, чем рекомендованная, между тем как системы охлаждения не всегда легкодоступны. Поэтому комиссия по ферментам в руководстве, изданном в 1964 г.1, предложила в качестве стандартной температуру 30 °С, что было ближе к 37 °С —температуре, при которой функционируют многие ферменты в естественных условиях. Из последующих рекомендаций были изъяты ссылки на температуру, при которой следует определять ферментативную активность, и в последнее время наметилась тенденция вернуться к стандарту в 25 °С. Иногда невозможно или неудобно поддерживать точное значение требуемой температуры. В этих случаях используют поправку — величину Qю (активность при Т+ + Ю°С, деленную на активность при Г°С), которую легко определить. Если точное значение этой величины для данного фермента не известно, можно использовать Qio=l,8 (6% на градус). Следует помнить, что Ки может меняться не только в зависимости от pH, но и от температуры, и Qio точно отражает изменения Vmax, а не V. Не всегда отдают себе отчет, как сильно влияет температура на определяемые величины; иногда студенты стараются во что бы то ни стало снизить ошибку определения ферментативной активности до 11 %, но в то же время не знают, какова была точная (хотя бы в пределах нескольких градусов) температура измерений! Чтобы определить ферментативную активность с ошибкой порядка 5%, необходимо знать температуру раствора с точностью до 0,5 °С.
8.2. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ С ПОМОЩЬЮ ПЕРИОДИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Чтобы измерить активность фермента, необходим метод определения количества образовавшегося продукта (или иногда количества израсходованного субстрата). Такой метод может включать стадию разделения субстратов и продуктов после реакции; можно также измерять концентрацию одного из компонентов смеси независимо от присутствия другого. Удобно разделить способы измерения активности ферментов на две группы: периодические (stopped) и непрерывные методы. Последние будут рассмотрены в следующем разделе. Непрерывные методы позволяют следить за ходом реакции во времени, не прерывая ее течения, что является большим преимуществом. Однако непрерывные методы имеют ряд ограничений, и для многих ферментов нет подходящих способов таких измерений. Периодиче-
1 Номенклатура ферментов (см. [158]).
Измерение активности ферментов
287
Рис. 8.4. Ход реакции во времени и возможность занижения начальной скорости реакции при периодическом методе тестирования вследствие постепенного замедления реакции. Время
ские методы можно использовать почти для всех ферментов, но обычно они менее удобны.
При периодическом способе определения активности фермент инкубируют с его субстратом в течение определенного периода времени, и затем реакцию останавливают каким-либо образом. Измеряют количество образовавшегося продукта исходя из предположения, что скорость реакции изменялась линейно в течение всего периода инкубации начиная с нулевого времени. Первое, что нужно проверить при использовании периодического метода, это предположение о линейности. Одна точка может дать заниженное значение начальной стационарной скорости реакции, если к тому времени, когда реакция была остановлена, ее скорость уже снизилась (рис. 8.4). С другой стороны, наличие лаг-периода в ходе ферментативной реакции также даст заниженное значение скорости, если ее определение основано на данных одного измерения. Чтобы проверить линейность изменения скорости реакции, необходимо провести серию инкубаций в течение разных периодов времени. Это особенно важно в случае использования неочищенных экстрактов тканей, так как при этом возможны многие побочные реакции. В результате продукт ферментативной реакции, который пытаются определить, может подвергнуться превращению под действием другого, следующего в метаболической цепи фермента. Более подробное обсуждение методов определения ферментативной активности в сырых тканевых экстрактах приводится в работе [167].
