Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 110

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 145 >> Следующая

Большинство исследователей, сталкивающихся с проблемой очистки ферментов, используют стандартные методы определения их активности. Однако в ряде случаев полезно разработать какой-либо альтернативный способ, например быстрый спектрофотометрический метод, чтобы избежать очереди к сцинтил-ляционному счетчику. Изредка возникает необходимость в новом методе тестирования для того или иного вновь обнаруженного фермента. В конечном счете биохимик хочет знать, какова зависимость между активностью фермента in vitro и физиологическими условиями, в которых он функционирует. Однако pH» ионная сила и особенно концентрация субстрата in vivo, скорее всего, весьма отличаются от условий, используемых при измерении ферментативной активности в ходе очистки фермента. В последнем случае все, чт,о нужно исследователю, — это* надежный и воспроизводимый метод, с помощью которого можно получить сведения о количестве фермента в каждой фракции независимо от того, что означает понятие «активность» в физиологическом смысле.
Ферментативная активность зависит от концентраций субстрата (или субстратов), активаторов и ингибиторов, специфичных для данного фермента, и от неспецифических влияний таких соединений, как соли и компоненты буфера, а также от pH, ионной силы и температуры, а иногда и от взаимодействий с другими белками или компонентами мембран, которые могут присутствовать в реакционной смеси. Обычно стремятся создать оптимальные условия для протекания ферментативной реакции* с тем чтобы фермент проявлял максимальную активность (Vmax). Однако это не всегда возможно либо из-за слишком высокой стоимости субстрата или его плохой растворимости, либо потому, что оптимальные условия для данного фермента несовместимы с условиями, необходимыми для другого (сопрягающего) фермента, без которого нельзя определить активность исследуемого фермента. Эти условия будут рассмотрены ниже.
19—1078
.278
Глава 9
Концентрация субстрата, активаторы и ингибиторы
Активность фермента почти всегда максимальна при самой высокой (из всех возможных) концентраций субстрата. Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса — Ментен, то следует использовать концентрацию субстрата, по крайней мере в tl0 раз превышающую величину Км. При [S]o=10/Cm скорость реакции составляет 91% ее теоретического значения при бесконечно большой концентрации субстрата. Следует помнить, что концентрация одного субстрата обычно влияет на Км. другого, причем характер этого влияния зависит от механизма реакции. Например, для многих реакций, в основе которых лежат последовательные механизмы, справедлива такая зависимость: чем выше концентрация субстрата В, тем ниже /См для А, и наоборот. Таким образом, высокая концентрация одного субстрата (скажем, самого дешевого) означает, что концентрация другого субстрата должна быть меньше, чтобы достичь значения 10 Км* С другой стороны, реакции с непоследовательными механизмами (например, «пинг-понг») имеют то удивительное свойство, что чем выше концентрация одного субстрата, тем выше /См (т. е. ниже кажущееся сродство) для другого; поэтому для достижения Vmax могут потребоваться очень большие концентрации обоих субстратов.
Есть две причины работать в области концентраций, существенно превышающих величину /См. Во-первых, небольшие изменения концентрации при переходе от одной серии измерений к другой почти не сказываются на результатах определения. Так,
Рис. 8.1. Влияние расходования субстрата на активность фермента. А. Соотношение между скоростью реакции и концентрацией субстрата. Б. Наблюдаемые скорости реакции в зависимости от расходования субстрата. Начальные концентрации субстрата равны 10 /См (непрерывная линия) и 2 Км. (прерывистая линия).
В
Измерение активности ферментов
27»
Таблица 8.1. Скорость ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата1*
Концентрация Концентра Концентра Скорость
ция суб ция про <% от ^rnax)
страта дукта
Начальная 10 /См 0 91
Конечная (после удаления про 9 /См 0 90
9 /См 1 KiP 82

2 Км 0 67

Конечная (после удаления про 1 /См (J 50
1 Кы I Kip 33


') *M-константа Михаэлиса для субстрата, --- ннгнбнрующая концентрации
продукта. Предполагается, что равно
ошибка в концентрации на 10% приводит только к 1%-ному изменению скорости, что с трудом поддается определению. Таким образом, нет никакой необходимости знать точную концентрацию субстрата, тем более что иногда ее трудно определить. Во-вторых, расходование субстрата в ходе определения будет очень мало влиять на скорость реакции (рис. 8.1), и если накапливающиеся продукты обладают ингибирующим действием,, то оно будет меньше проявляться при высокой концентрации субстрата (табл. 8.1). В табл. 8Л приведен пример, когда продукт связывается с ферментом столь же прочно, как и субстрат. Если такой продукт не удалять в ходе определения, скорость реакции будет неуклонно снижаться и истинная начальная скорость окажется заниженной. К ферментам такого типа относятся ферменты, катализирующие легко обратимые реакции, например изомеразы. Иногда технически удобно измерять активность фермента в реакции с положительным значением АС0, когда равновесие сдвинуто в сторону субстратов. В таких случаях желательно удалять все продукты в ходе определения. Удаление продуктов происходит естественным путем при использовании сопряженных методов определения активности (см. разд. 8.3). Однако может оказаться, что удалять продукты реакции полезно даже в случае применения периодических методов определения ферментативной активности (см. разд. 8.2).
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed