Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Этим способом можно измерять активность большинства киназ, заменяя фруктозо-6-Р подходящим субстратом.
Принцип такого определения ясен. На практике возникают по крайней мере четыре вопроса:
Рис. 8.9. Принцип сопряженного определения фосфофруктокиназы с использованием лактатдегидрогейазы в качестве индикаторного фермента.
Измерение активности ферментов
299
.1) Сколько нужно взять сопрягающего фермента, чтобы быть уверенным, что катализируемая им реакция не является этапом, лимитирующим скорость всего процесса?
2) Доступен ли сопрягающий фермент в достаточном количестве?
3) Нет ли в сопрягающем ферменте примесей (особенно того фермента, активность которого измеряется)?
4) В какой степени могут другие ферменты, присутствующие в определяемом образце, искажать данные измере» ний?
Рассмотрим сначала вопрос о количестве необходимого фермента. Если ответы на вопросы 2 и 3 будут соответственно «да» и «нет», то для решения вопроса 1 нужно будет использовать большое количество сопрягающего фермента, чтобы со* здать такие условия, в которых общая скорость реакции лимитировалась бы определяемым ферментом. Метод проб и ошибок может помочь в этом отношении, но если сопрягающие ферменты стоят дорого, то важно знать, какое минимальное их количество необходимо. Часто в опубликованных методах рекомендуются неоправданно большие количества сопрягающих ферментов, которые могут иметь только хорошо финансируемые исследователи. Основной принцип заключается в том, что необходимо достичь стационарного состояния, при котором скорость реакции, катализируемой индикаторным ферментом, равна скорости реакции с участием определяемого фермента. Теоретически этого, однако, нельзя достичь, а можно лишь асимптотически приближаться к такому состоянию. Поэтому, во-первых, следует решить, насколько близко хотелось бы приблизиться к этому состоянию и за какой период времени. Типичное спектрофотометрическое определение занимает несколько минут; при измерении объемов с помощью пипеток и регистрации данных в приборе точность определения редко бывает выше чем ±2%. Если мы ограничим наши требования и удовлетворимся тем, что через 1 мин после запуска реакции достигается 98% истинной скорости, то количество нужного нам фермента не будет слишком большим.
Чтобы вычислить необходимое количество сопрягающего фермента, следует сначала определить подходящую для данного случая скорость процесса. Для NADH величина ДА34о, составляющая около D,2 мин-1, вероятно, будет оптимальной (более высокая скорость может привести к тому, что NADH израсходуется прежде, чем будет достигнут заданный 98%-ный предел).
В простой сопряженной системе, показанной на рис. 8.10, продукт Р накапливается как раз в достаточном количестве, чтобы фермент Ер мог функционировать с той же скоростью.
Скорость ДА34о=0,2 мин-1 эквивалентна примерно 0,03 ед.*мл”Ч В стационарном состоянии величина [Р] очень мала; однако определен-
но*
Концентрации
300
Глава 8
Время
Рис. 8.10. Концентрации промежуточного (Р) и конечного (Q) продуктов при одностадийном сопряженном определении фермента.
ное количество Р должно присутствовать, иначе фермент вообще не будет работать. Если [Р]</Срм (константа Михаэлиса для фермента Ер по отношению к продукту Р), то скорость реакции, катализируемой Ер, будет
.. Vmax [Р]
к? -м
Через промежуток времени t после начала реакции образуется [Р] и
<*[Р1 ^шах[Р]
dt
К
м
где г — скорость реакции, катализируемой определяемым ферментом; она является постоянной величиной, так как фермент насыщен субстратом. Интегрируя это уравнение, получаем
[Р] /
d[ Р]
J, .twpi ~ Idt'
/1 t ---------------------- Г» ft
In
c[PI
Kp
AM
Теперь, чтобы найти условия, когда v составляет 98% от г, используем следующее уравнение:
:[Р]
Кр
Ам
:0,98г;
следовательно,
In
[г—0,98г]“'
^гпах^
In 50 = 3,9.
При t— 1 мин получим
*рм
= 3,9 мин-1.
Измерение активности ферментов
301
Рис. 8.11. Двустадийная сопряженная реакция, в ходе которой продукт Р превращается в Q, а затем в R с помощью ферментов ЕР и Eq. А. Отложены концентрации Р, Q и R\ Vm&x/K м = 5 МИН-1 ДЛЯ Ер и Eq; Р—>Q практически необратима. Б. VmaxfKvi^S МИН”1 для Ер и Eq; Р—>Q обратима, и равновесие сдвинуто в сторону Р. Обратите внимание, что скорость образования R все еще возрастает при
