Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
^max*[S]
*м
здесь выполняется.
Если требуется, чтобы сопрягающая система достигла 98% истинной скорости в более короткое время, то необходимо увеличить количество сопрягающего фермента на соответствующую величину. Например, если время должно составлять 10 с вместо 1 мин, надо умножить указанные выше концентрации фермента на 6. Более подробный анализ сопряженных методов определения ферментов дан в работе [169].
Выполнив эти расчеты и оценив число необходимых тестов, следует поставить вопрос — имеется ли в наличии или можно ли приобрести достаточное количество сопрягающих ферментов? В случае, рассмотренном выше, когда в пробе объемом 1 мл должно содержаться 2 ед.*мл-1 пируваткиназы и 5 ед.-мл-1 лактатдегидрогеназы, расходы на приобретение ферментов будут незначительными. С другой стороны, ферменты, обладающие низкой удельной активностью, стоят намного дороже в расчете на одну единицу активности, а если к тому же они имеют высокие значения Км, потребуется еще большее число единиц фермента. Таким образом, некоторые превосходные методы обходятся настолько дорого, что использовать их в текущей работе оказывается невозможно. Другая сторона /того же вопроса— это доступность ферментов (что необходимо выяснить в самом начале), связанная не столько с их ценой, сколько с тем, имеются ли вообще в продаже такие препараты, а если нет, то можно ли получить их в лаборатории. Возьмем для примера ферменты метаболического пути Энтнера — Дудорова. Чтобы тестировать фермент 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, необходим следующий фермент этого метаболического пути —
304
Глава 8
3-кето-2-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза (КДФГ-альдолаза). Этот фермент не выпускается промышленностью, и его необходимо очищать. Чтобы тестировать его, в свою очередь необходим субстрат. Его тоже нет в продаже, но это уже другая история. При наличии же запасов альдолазы можно легко измерить дегидрогеназную активность:
Г лицеральдегид-З-Р
6-Ртлкжонат
КДФГ
Лактат
где ЕР — КДФ-альдолаза и Eq — лактатдегидрогеназа.
Еще один вопрос касается примесей. Если сопрягающий фермент содержит любой из определяемых ферментов, даже в контрольных пробах будет идти реакция с той или иной скоростью. Если эта скорость невелика, можно просто ввести соответствующую поправку (рис. 8.12). Примеси такого типа очевидны, и их влияние легко учитывается, хотя они могут снижать чувствительность определения. С другими примесями положение не столь ясно, и их влияние иногда обнаруживается слишком поздно.
При тестировании сырых экстрактов обычно возникают проблемы, связанные с присутствием кроме определяемого еще целого ряда других ферментов, которые могут искажать результаты. Эти проблемы распадаются на две категории: 1) сырой экстракт содержит достаточное количество других субстратов
X
Cl
<
Добавлен сопрягающий фермент
Добавлен определяемый образец
Время
Рис. 8.12. Ход сопряженной реакции, сопровождающейся окислением NADH. В контроль-Опыт + Контроль ном опыте также наблюдается эта реакция, протекающая с небольшой скоростью вследствие того, что в сопрягающих ферментах присутствует примесь определяемого фермента.
Измерение активности ферментов
(а также ферментов), чтобы все обнаружимые реакции могли осуществляться; 2) на используемую сопрягающую систему могут влиять другие ферменты. Трудности в основном возникают, когда определяемый фермент имеет относительно низкую активность, поскольку в этом случае необходимо использовать большие количества образца, что увеличивает вероятность ощутимых помех. Например, если измеряется активность киназы по образованию ADP с помощью пируваткиназы и лактатдегид-рогеназы, как описано выше, добавление достаточного количества глюкозы в образец (обычно в экстракты печени) будет активировать гексокиназу, а не только тестируемую киназу. Окисление NADH может происходить благодаря присутствию «NADH-оксидазной системы». Образование NADPH снижается из-за наличия в пробе глутатионредуктазы и окисленного глутатиона. Существует много таких возможностей, и если возникло подозрение, что имеют место какие-то помехи, то лучший способ выяснить, что же происходит на самом деле, — это спросить себя: «За чем я наблюдаю?» Обычно на этот вопрос
Таблица 8.3. Сравнение достоинств и недостатков периодических и непрерывных методов тестирования ферментативной активности
Периодические методы Непрерывные методы
Нет ограничений в условиях
Использование очень малых объемов позволяет экономно расходовать дорогие реактивы
Высокая чувствительность радиохимических методов
Определение в одной точке может маскировать непостоянный уровень активности Результаты получают не сразу Необходимо проводить сложные манипуляции, занимающие много времени
Не требуется сопрягающих ферментов при определении (но они могут понадобиться для измерения количества продукта)
