Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 114

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 145 >> Следующая

Условия инкубации
Для периодических методов нет ограничений в отношении условий инкубации реакционной смеси. Следует подобрать оптимальное значение pH, но иногда предпочтительнее работать
288
Глава 8
при pH, несколько отличающемся от оптимального, чтобы сдвинуть равновесие реакции в нужную сторону. Температура легко поддается контролю, и объем реакционной смеси может быть очень небольшим (обычно 50—100 мкл), что позволяет экономно расходовать реактивы. Образец фермента при быстром перемешивании добавляют к остальным компонентам реакционной смеси, и этот момент считают нулевым временем. Реакция продолжается в течение какого-то определенного времени, а затем ее останавливают. Для стабилизации разбавленных растворов ферментов в реакционную смесь часто вводят бычий сывороточный альбумин (0,2—il мг/мл).
Способы остановки реакции
Ферментативную реакцию останавливают каким-либо способом, который или приводит к мгновенной денатурации фермента, или изменяет условия так, что фермент утрачивает активность, но не обязательно денатурирует. Наиболее часто используемые способы остановки реакции заключаются в подкис-лении пробы (обычно трихлоруксусной или надхлорной кислотой), что вызывает осаждение белка, или в быстром ее нагревании. Последний способ имеет некоторые преимущества, особенно тогда, когда разбавление образца нежелательно. Однако нагревание должно быть очень быстрым. Пробы очень небольшого объема, помещенные в тонкостенные пробирки (не пластиковые), нагреваются в кипящей водяной бане за 1 с до 90 °С; этого вполне достаточно для денатурации большинства ферментов. Скорость денатурации должна быть настолько высокой, насколько необходимо, чтобы фермент мог полностью инактивироваться за эту секунду. В противном случае неденатурировавшая часть фермента будет реагировать очень быстро и дополнительно даст значительное количество продукта. Это особенно важно, если для определения активности используют короткое время инкубации. Денатурацию нагреванием лучше применять в случае длительной инкубации реакционной смеси (>10 мин). При этом дополнительное количество продукта, образовавшегося в ходе нагревания, будет относительно небольшим.
Трихлоруксусная и надхлорная кислоты при конечной концентрации 3—5% немедленно останавливают реакцию, так как после добавления их к реакционной смеси значение pH снижается почти до нуля, в результате чего белок денатурирует и выпадает в осадок. После удаления осадка путем центрифугирования иногда приходится нейтрализовать надосадочную жид-:
Измерение активности ферментов
289-
КОСТЬ перед измерением количества продукта. Для этого используют КОН, содержащий небольшое количество К2СО3. Большая часть надхлорной кислоты при этом удаляется, так как образовавшаяся соль КСЮ4 трудно растворима, особенно при 0°С. Однако трихлорацетат калия остается в растворе. Карбонат удобен тем, что он обладает буферным действием & области нейтральных значений pH; благодаря этому не происходит слишком сильного повышения pH, а значит, и разложения неустойчивых в щелочной среде продуктов реакции. Можно вводить в смесь индикатор типа бромтимолового синего, если есть уверенность в том, что он не мешает измерению количества продукта. Некоторые кислотоустойчивые ферменты не полностью осаждаются этими кислотами и при нейтрализации могут реактивироваться. Среди прочих к таким ферментам относятся: аденилаткиназа и ATP-аза из картофеля. Контрольное измерение после остановки реакции в нулевое время позволяет выявить подобную реактивацию. Такое измерение следует делать во всех случаях, поскольку оно дает истинную нулевую точку для отсчета. Измеряемое вещество (продукт реакции) может содержаться или в образце фермента, или в реактивах, что приведет к неправильной точке отсчета.
Еще один очень хороший способ остановки реакции (опять-таки при условии, что он не влияет на дальнейшие измерения) состоит в добавлении к реакционной смеси додецилсульфата натрия в концентрации около 1%. Большинство ферментов быстро денатурирует под действием этого детергента, но остается в растворе.
Для остановки реакции можно также использовать способы, не вызывающие денатурации белков, в тех случаях, когда есть уверенность, что дальнейшие манипуляции не приведут к созданию условий, способствующих возобновлению реакции. Например, фермент, активный только при pH ниже 8, можно инактивировать, если довести pH до 9, а затем поддерживать это значение pH во время измерений. Фермент, функционирующий только в присутствии ионов двухвалентных металлов, инактивируется при добавлении избытка этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Но при этом надо убедиться, что в присутствии этого вещества продукт реакции можно сразу же измерить или сначала выделить его из реакционной смеси. При измерениях ферментативной активности радиохимическими методами реакцию можно останавливать, разбавляя смесь немеченым субстратом; в результате будет дополнительно образовываться очень мало радиоактивного продукта. Можно также добавлять большой избыток какого-либо известного ингибитора фермента. Существует много способов остановки ферментативных реакций,, пригодных только для данного конкретного фермента.
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed