Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Любое определение требует известного времени для его завершения. Если пренебречь временем достижения начального стационарного состояния, занимающего всего лишь несколько миллисекунд, то скорость реакции должна быть постоянной от нулевого времени и до того момента, когда можно обнаружить
19*
280
Глава 8
визуально или точно измерить образование продукта реакции. Чтобы решить проблемы, связанные с ингибированием реакции образовавшимся продуктом, и достичь равновесия, применяют разные подходы: используют очень высокие концентрации субстрата, нефизиологические значения pH (если в реакции участвует протон) или весьма чувствительные методы определения продукта, позволяющие ограничиться малой степенью превращения субстрата. В качестве примера приведем реакцию, катализируемую малатдегидрогеназой, которая в физиологических условиях идет в прямом и обратном направлениях:
Малат2--|-NAD+ Оксалоацетат2- -j-NADH -}- Н+
При pH 7 равновесие сильно сдвинуто влево; тем не менее Еысокое отношение NAD+/NADH в клетке, а также быстрое удаление оксалоацетата могут привести к тому, что суммарный процесс будет идти слева направо. Внутри клетки реакция, конечно, одновременно идет и в противоположном направлении, но в целом превалирует катализ в направлении образования оксалоацетата. Значительная доля присутствующего фермента используется для катализа обратной реакции, так что прямая реакция протекает в условиях, далеко не обеспечивающих достижения Утах» т. е. слабо зависит от количества присутствующего фермента. Так как целью является определение количества фермента, необходимо выбрать такие условия, когда обратная реакция не идет. Активность малатдегидрогеназы определяют непосредственно по образованию NADH (или в обратной реакции по исчезновению NADH), поскольку NADH поглощает при 340 нм, тогда как у NAD+ поглощение в этой области отсутствует (рис. 8.2). Фермент можно определять в термодинамически благоприятном направлении, используя оксалоацетат и NADH при pH 7 или немного ниже. При этом получают определенное значение активности. Кроме того, активность фермента можно определять, вынуждая реакцию идти в прямом направлении. Это достигается 1) в присутствии высоких концентраций малата, обычно 50—100 мМ; 2) при высоких значениях pH (9—110), так как в этих условиях образующиеся протоны связываются, и 3) путем удаления оксалоацетата в виде гид-разона:
СООН"
<ь
I + nh2nh. сн2
соо-
СОО-
i=N.NH#
н.
оо-
Измерение активности ферментов
281
Рис. 8.2. Л. Спектры поглощения NADH и NAD+.
?. Спектр флуоресценции NADH при возбуждении
светом с длиной волны
365 нм.
Длина волны, нм
Если все эти три условия соблюдены, активность фермента можно измерить по образованию NADH. Следует отметить, что в данном случае нет оснований ожидать одинаковой активности, выраженной в абсолютных единицах, при протекании реакции в прямом и обратном направлениях. Для ферментов, катализирующих обратимые реакции в физиологических условиях, активность в обоих направлениях часто бывает сходной. В случае же малатдегидрогеназы максимальная скорость реакции, достигаемая в прямом направлении, примерно в два раза меньше, чем в обратном.
Обычный график зависимости активности фермента от концентрации субстрата — гипербола, асимптотически приближающаяся К 1/тах (рис. 8J1 ,А), — не соответствует кинетическому поведению ферментов, для которых характерны аллостериче-ские эффекты или явление «субстратного ингибирования». В случае аллостерических ферментов условия определения выбирают так, чтобы в смеси присутствовали все необходимые активаторы, а концентрация субстрата была высокой. В этих условиях аллостерические эффекты часто не наблюдаются. Термин субстратное ингибирование означает, что фермент проявляет пониженную активность при высоких концентрациях субстрата. Если активность малатдегидрогеназы (см. выше) определя-
282
Глава 8
ют с помощью реакции, направленной в сторону образования малата, то концентрации оксалоацетата, превышающие 0,2 мМ, приводят к снижению скорости реакции из-за образования прочного абортивного комплекса — оксалоацетат — NAD+ — фермент. В других случаях причины субстратного ингибирования не столь ясны. Дрожжевую пируваткиназу определяют при очень высоких концентрациях субстратов (фосфоенолпирувата и ADP) и активатора (фруктозо-11,6-бисфосфата), а именно при 10 мМ концентрации каждого из этих соединений; такая концентрация примерно в 100 раз превышает величину Км [165]. Однако при il мМ концентрации каждого из указанных компонентов реакции достигается более высокая активность (и при меньших затратах!). Теперь надо учесть, что 10 мМ концентрации фосфоенолпирувата, ADP и фруктозо-1,6-бисфосфата дают раствор с ионной силой, равной 0,26 М, что вместе с присутствующим буфером составляет в целом ионную силу 0,4 М — величину, намного превышающую физиологическую ионную силу* Возможно, что именно это и приводит к кажущемуся «субстратному ингибированию». При работе с субстратами, несущими большое число зарядов, следует учитывать их влияние на ионную силу.
