Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
2 мин. В. То же, что и на рис. Б, НО 1/тах//(м—25 МИН"1 для Ея. Скорость образования R достигает стационарного состояния за 1 мин; значение [Q] намного меньше, чем в случае Б.
Таким об,разом, количество фермента рр, необходимое для того, чтобы скорость сопряженной реакции достигла за 1 мин 98% истинной скорости, можно найти из приведенного выше уравнения. Величина Ушах, выраженная в мкмоль-мл-1-мин-1, — это число единиц фермента в одном миллилитре раствора, a Kmv — константа Михаэлиса в отношении Р. Следовательно, необходимое число единиц фермента решающим образом зависит от /Смр: ед.'МЛ-1 = 3,9-Кмр. Так как были сделаны некоторые допущения (которые могут не оправдаться при очень малых ве-
302
Глава 8
личинах Кмр), минимальное количество Ер можно определить как 5/Смр. Следует отметить, что, когда обсуждалось применение ферментов для измерения количества (а не скорости) образовавшегося продукта с помощью периодических методов (см. разд. 8.2), было указано, что количество сопрягающего фермента должно составлять около 11/Смр, чтобы реакция могла завершиться за 10 мин. Обе величины, Утах и Км9 для сопрягающего фермента, относятся к условиям, существующим в буфере, в котором проводят тестирование (не обязательно в оптимальных условиях для сопрягающего фермента). Если сопрягающий фермент взаимодействует со вторым субстратом, концентрация которого не является насыщающей, необходима дополнительная коррекция «эффективного» значения Vmax.
В условиях, когда используются два или более сопрягающих фермента, можно провести сходные расчеты. Количество каждого фермента, необходимое теоретически, немного больше, чем в том случае, когда используется один фермент (Утах/Км~ ~10 мин™1 для каждого фермента, но количество второго фермента зависит от того, в каком количестве присутствует первый, и наоборот). Вполне вероятно, что не все реакции в данной последовательности необратимы. Если это так, то потребуется больше того фермента, который функционирует на стадии, следующей за обратимой реакцией (рис. 8.11). В этих условиях нет смысла вводить больше фермента ЕР, катализирующего обратимую реакцию. Однако фермент Eq вынужден будет работать при более низком уровне Q, и его придется брать больше.
Обычно применяемый способ определения киназной активности основан на измерении образования ADP с помощью пируваткиназы (ЕР) и лак-татдегидрогеназы (Eq). Этот пример будет использован для вычисления количеств сопрягающих ферментов. Оба фермента катализируют практически необратимые реакции (ДО0—большая отрицательная величина), поэтому достаточно, чтобы величины Vmax/Км составляли около 5 мин-1. Величина /См для пируваткиназы в данном случае относится к ADP. В литературе существуют несколько противоречивые суждения о том, что служит истинным субстратом для этого фермента — ADP3- или MgADP-; количество каждой из этих двух форм должно зависеть от присутствия свободных ионов магния, которые так или иначе необходимы для реакции. Км, равная 0,2 мМ, — это вполне разумная величина. Фосфоенолпируват, другой субстрат этого фермента, обычно используется в концентрации 0,2—0,5 мМ, что близко к насыщению. Существенную роль в реакции играют также ионы калия, и они должны присутствовать в концентрации 0,1—0,15 М, чтобы реакция протекала в оптимальном режиме. Если при такой высокой концентрации ионов К+ соответствующую киназу нельзя тестировать, то необходимо ввести соответствующую поправку в величину Ушах Для пируваткиназы. Количество фермента должно быть равно по крайней мере 1 ед.-мл-1 (5 ЯмАОР). Содержание фермента, указанное на коммерческих препаратах пируваткиназы, несомненно, относится к оптимальным условиям, поэтому целесообразно увеличить количество фермента в пробе до 2 (оптимум) ед.*мл-1. Если измерение проводится при pH 8, когда пируват-
Измерение активности ферментов
303
киназа имеет относительно низкую активность, следует использовать по меньшей мере в 5 раз больше фермента, чем требуется исходя из теоретических расчетов, т. е. 5 ед.-млА
Количество необходимой лактатдегидрогеназы зависит от ее происхождения. Наблюдаемая величина /См относится к пирувату; ферменты из скелетных мышц имеют более высокое значение Км, чем ферменты из сердечной мышцы. С другой стороны, удельная активность ферментов из скелетных мышц также несколько выше. Если /См для пирувата равна 0,5 мМ, то минимальное количество лактатдегидрогеназы будет составлять 2,5 ед.-мл-1. Однако фермент может быть не полностью насыщен своим вторым субстратом — NADH, и потому количество лактатдегидрогеназы следует увеличивать до 5 ед.-мл"1. Таким образом, лактатдегидрогеназы может потребоваться больше, чем пируваткиназы, и не потому, что она — второй фермент, а из-за ее меньшего сродства к своему субстрату.
Можно вычислить истинные концентрации промежуточных продуктов ADP и пирувата. Если принять, что Ушах/Км—5, то скорость и = 0,03 ед. и в стационарном состоянии [ADP] =/CmadpX0,03/5= = 0,0012 мМ, а [Руг] =/СмругХ0,03/5=0,003 мМ. В обоих случаях эти величины удовлетворяют исходному условию: [субстрат] /См, и поэтому упрощенное уравнение
