Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Радиохимические методы основаны на обнаружении меченых продуктов реакции, которые должны быть полностью отделены от оставшегося меченого субстрата. Разделение — это обычно наиболее длительная стадия, которая вносит наибольшую ошибку в конечный результат. Продукт можно отделить от реагента по принципу фазового разделения, например осаждая меченый белок из раствора, содержащего реагент, или удаляя меченый СОг из смеси; принцип метода достаточно прост, хотя существует много практических трудностей. В других случаях необходимы хроматографические методы. Для этого используют хроматографию на бумаге или в тонком слое, ионообменную хроматографию или жидкостную хроматографию высокого разрешения. Иногда эти процедуры протекают очень быстро и просто, особенно в ситуациях «все или ничего», когда какой-либо один компонент пары продукт — реагент полностью сорбируется на носителе, а второй не сорбируется вовсе. Но бывает и так, что разделение идет с трудом, особенно тогда, когда в смеси присутствует в большом избытке субстрат. Из-за обычной диффузии может произойти перекрывание зоны субстрата с зоной продукта, и тогда содержание продукта будет ошибочно завышено, если не будут поставлены соответствующие контрольные пробы (рис. 8.6).
Измерение активности ферментов____________________________293
Контроль
Ьольшоп избыток субстрата приводит к перекрыванию его полосы с полосой продукта и Н'М имым к завышению [Р]
¦рафия
пробег при
пав торн ом разделении
Жидкостная хроматография высокого разрешения позволяет достичь разделения, в значительной степени устраняющего описанные выше проблемы. Во многих случаях не возникает даже необходимости использовать меченый субстрат, так как даже очень малые количества продуктов реакции можно измерить непосредственно методами рефрактометрии или УФ-поглоще-ния. Эта техника используется все шире для трудноопределимых веществ, требующих высокоэффективных методов разделения.
Суммируя все изложенное в этом разделе, можно сказать, что периодические методы имеют свои достоинствами недостатки по сравнению с непрерывными методами (для сравнения см. табл. 8.3). Для рутинных анализов непрерывные методы благодаря их быстроте и легкости выполнения предпочтительны, при условии что такие методы существуют и имеют достаточную чувствительность. Радиохимические методы основаны на применении периодического принципа и обычно (но не всегда) обладают самой высокой чувствительностью.
S Р
АА
Рис. 8.6. Трудности, возникающие при хроматографическом разделении субстрата и продукта реакции.
А Л
Полное рлзделеии
294
Глава 8
8.3. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕПРЕРЫВНЫМИ МЕТОДАМИ
Под непрерывными методами определения ферментативной
активности подразумеваются такие методы, которые позволяют непрерывно следить за ходом реакции, начиная от нулевого времени и до ее завершения, причем обычно производится мгновенная регистрация данных. Есть довольно большая группа ферментов, у которых образование продукта реакции или убыль субстрата можно наблюдать непосредственно вследствие того, что существует различие в спектре поглощения между продуктом и субстратом. Кроме того, суммарным результатом реакции может быть образование кислоты или основания, изменение вязкости или даже выделение тепла. Эти явления также можно регистрировать непосредственно. К важнейшим ферментам этого типа относятся дегидрогеназы, использующие NAD или NADP, многие гидролазы, расщепляющие синтетические
Таблица 8.2. Примеры несопряженных непрерывных методов, используемых
дли определения ферментов
Фермент Реакция Наблюдение
Лактатдегидроге-наза (1)'
Лактатдегидроге-наза (2)
Неспецифические
фосфатазы
Гликозидазы
Ксантиноксидаза
Эндоцеллюлаза
Гексокиназа
Химотрипсин
Лактат-Ь1^ЛО+—>Пируват4-+NADH+H1- (высокий pH)
NADH+Пируват+Н 1 -тат+NAD*
-Лак-
NOz О 0
© "*
ыо? О он +
Метилумбеллиферилглкжо-зид—>-Сахар4-Метилумбел-лиферон Ксантин+02—^Мочевая кис-лота+Супероксид
Целлюлоза—>Юлиго-|3-глюко-сахариды Глюкоза+MgATP2-—>Тлюко-30-6-P2'-|-MgADP”+H+ (высокий pH) м-Нитрофениловый эфир N-t-BOC-L-фенилаланина—у N-t-BOC-L-фенилаланин-}-п- Нитрофенол
Образование NADH по поглощению при 340 нм
Расход NADH по поглощению при 340 нм 405 нм
Образование нитрофенола по поглощению при 405 нм
Флуоресценция метил-умбеллиферона
Образование мочевой кислоты по поглощению при 295 нм
Снижение вязкости
Образование
(рН-стат)
кислоты
Образование нитрофенола по поглощению при 405 нм
Примечание, Для некоторых из приведенных ферментов периодические методы более чувствительны, так как максимальное поглощение или флуоресценция наблюдаются при pH, отличающемся от оптимума pH фермента.
Измерение активности ферментов
295
субстраты с образованием окрашенных или флуоресцирующих продуктов, а также эндогидролазы, действие которых на субстраты сопровождается снижением вязкости. Теоретически за любой ферментативной реакцией, в ходе которой происходит заметно отличающееся от .нуля изменение энтальпии, можно проследить с помощью имеющихся в продаже чувствительных калориметров. Хотя калориметрическое определение ферментов распространено не очень широко, его можно применять в тех случаях, когда другие методы непригодны. Все эти методы, о которых говорилось выше, можно назвать «несопряженными непрерывными» методами определения, чтобы отличить их от сопряженных способов, описанных ниже. Некоторые примеры несопряженных непрерывных методов приведены в табл. 8.2.
