Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Такое точное указание объема в данном случае не имеет никакого смысла; 450 или 500 мл дадут одинаково хорошие результаты— в любом случае объем изменится при диализе.
«...элюцию проводили с помощью линейного градиента NaCl; собирали фракции объемом около 3 мл... фракции, содержащие активность (от 41 до 53), смешивали».
Номера пробирок ничего не говорят читателю, так как авторы точно не указали, какой объем прошел через колонку до того, как появилась активность.
«...подвергали диализу против буфера В в течение 24 ч».
Была ли смена диализата? Какой объем буфера В использовался? Это может быть очень важным для проведения диализа и следующей стадии.
«Смесь нагревали при постоянном слабом перемешивании в течение 10 мин при 62 °С».
Сколько времени ушло на нагрев смеси до 62 °С и как быстро она охладилась?
«Остатки разрушенной ткани осаждали в центрифуге «МСЕ Мистрал 62» при 2000 об/мин в течение 20 мин при 5°С».
Конечно, нет никакой необходимости идти и покупать центрифугу «МСЕ Мистрал 62» для выполнения этого этапа; авторам следовало бы указать относительную величину g, которая соответствует 2000 об/мин в данном аппарате.
«...КМ-целлюлоза, уравновешенная 5 мМ буфером трис-НС1, pH 6,5».
Это чрезвычайно странно, так как трис не обладает существенным буферным действием при pH 6,5, особенно если он имеет
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
275
5 мМ концентрацию. Эта стадия должна быть тщательно проанализирована и, возможно, модифицирована.
«...50 мМ Na-ацетатный буфер, pH 5,0».
Как был приготовлен этот буфер? Доводился ли 50 мМ Na-ane-тат до pH 5,0 уксусной кислотой или НС1? Описания состава буферов не всегда ясны. Насколько это важно? Для ионообменной хроматографии в равной степени важны как ионная сила, так и pH, поэтому состав буфера должен быть четко указан. С другой стороны, если величина pH указана правильно, то буферная сила и состав буфера иногда не имеют большого значения. Даже природа компонентов буфера не должна иметь значения. Буфер другого состава может оказаться вполне пригодным, при условии что он имеет то же самое значение рКа, что и указанный в методике буфер. Это существенно в том случае, если предлагаемый буфер имеет какой-то необычный состав или труднодоступен. Так, например, какодилат был в значительной степени вытеснен N-морфолиноэтансульфонатом (МЭС). N-Этилморфолин (рКа 7,7) лишь в редких случаях более предпочтителен, чем трис (р/Са 8,1) или триэтаноламин (рКа 7,8). Диэтилбарбитурат, называвшийся в более ранних работах вероналом (р/Са 8,0, п = — 1), также сейчас используется нечасто. Его лучше заменить трицином, если необходим анионный компонент буфера. Следует помнить, что некоторые буферы образуют комплексы с ионами металлов, и это может повлиять на стабильность фермента (см. разд. 6.1). Уже упоминалось о том, что нужно указывать не только значение pH буферного раствора, но и температуру, при которой измеряли pH, и, хотя авторы часто пишут: «все операции выполнялись при 4°С»,— наверняка в большинстве случаев значения pH буферов устанавливались при комнатной температуре.
«На каждые 100 мл экстракта добавляли 49 мл (0,25 насыщения) насыщенного сернокислого аммония».
Цифра в скобках явно ошибочна; 49 мл насыщенного (NH4)2S04, добавленные к 100 мл, составляют 49/149 = 0,33 насыщения. Та же самая ошибка повторялась несколько раз в этой работе, и очевидно, что авторы плохо представляли себе, что означает доля насыщения, или у них было свое собственное, не известное всем остальным определение. Хорошо, что была дана двойная информация, и, скорее всего, цифры, не заключенные в скобки, отражают то, что было сделано в действительности, т. е. то, что может быть воспроизведено. Если бы они только указали, что «насыщенный сернокислый аммоний был добавлен до 0,25 насыщения», тогда их ошибка привела бы к невоспроизводимости работы. В литературе встречается мно-
276
Глава 7
жество странных определений (например, «25%-ное насыщение» сернокислого аммония в значении 25 г/100 мл), и нужно быть твердо уверенным в том, что на самом деле имеется в виду.
После успешного воспроизведения опубликованной процедуры очистки следует подумать, нет ли в ней каких-либо сомнительных стадий и нельзя ли сделать какие-то усовершенствования. Решение попробовать что-то другое может быть целесообразным, если эта процедура была разработана еще до того, как появился какой-либо новый реактив или метод, которые могут упростить весь процесс. Но не следует вносить в методику несущественных изменений, если только вы не чувствуете большого разочарования в связи, например, с низким выходом активности, так как почти наверняка авторы уже затратили какое-то время на внесение в методику различных изменений и опубликовали то, что считали оптимальной процедурой. Если вы не уверены в отношении каких-либо деталей, кратчайший путь решить этот вопрос — связаться непосредственно с автором.
ГЛАВА 8
ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
8.1. ОСНОВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
