Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
форм фермента.
Изменение концентрации субстрата практически не влияло на ¦форму
кривой а от [Е]0 для препарата из сердца голубя, что, ло-видимому, можно
объяснить большим вкладом в смещение равновесия между олигомерами
изменения концентрации фермента, хотя даже при десятикратном повышении
концентрации последнего в пробе кривая v от [S]" не превращалась в
гиперболу. .Эти данные можно рассматривать как указание на то, что сдвиг
равновесия между молекулярными формами в препарате фермента из сердца
голубя осуществляется ^енее легко, чем в ферментном препарате из
скелетных мышц.
Известно, что кооперативные эффекты в диссоциирующих ферментных
системах могут быть обусловлены как смещением равновесия между
олигомерами, так и взаимодействием активных центров внутри каждого
олигомера [21]. Рассмотренные факты дозволяют оценить вклад первого типа
взаимодействий.
Следует подчеркнуть, что характерные для диссоциирующих -систем
свойства НАД-киназа утрачивает после очистки до гомогенного состояния.
По-видимому, НАД-киназа принадлежит к ферментам, слишком высокая степень
очистки которых приводит к изменению или даже исчезновению регуляторных
свойств.
Точку зрения о необходимости осторожного подхода к оценке
результатов, получаемых при исследовании высокоочищенных ферментов,
высказывают в своей монографии Э. Ньюсхолм и К. Старт [1]. Они указывают
на то, что следует стремиться к достижению известного компромисса между
использованием частично очищенных препаратов, в которых с наибольшей
вероятностью сохраняются регуляторные свойства фермента, и изучением
¦свойств очищенных до гомогенного состояния ферментов.
Регулятор НАД-киназы
Теперь попытаемся ответить на вопрос, что же происходит с НАД-киназой
после фракционирования на ионообменникё и очистки фермента до гомогенного
состояния.
Электрофоретически гомогенные ферменты отличаются большой
лабильностью и быстро, инактивируются при хранении. •Отмечали также
крайнюю неустойчивость фермента после ионообменной хроматографии НАД-
киназы из пивных дрожжей [20] и проростков гороха [9]. Причем фермент из
растений в отдельных случаях, а НАД-киназа из яиц морского ежа постоянно
[28] после указанной процедуры инактивировались полностьюлПричи-на
инактивации заключалась в том, что в процессе ионообменной хроматографии
от фермента отделялся фактор, в отсутствие которого НАД-киназа не
проявляла активности. Фактор более прочно, чем фермент, связывался с
ДЭАЭЦ и сходил с колонки при
148
<5олее высоком значении ионной силы буфера. Этим термостабильным,
недиализуемым фактором оказался кальмодулин [29, ¦30]. Помимо фермента из
проростков гороха фактор активировал НАД-киназу из большого числа
растительных объектов [9, 29]. Активирующий эффект кальмодулина
проявлялся только в присутствии ионов кальция. При добавлении
кальмодулина или содержащей его фракции, получаемой при фракционировании
на .ионообменнике, к неактивной НАД-киназе из проростков гороха фермент
полностью восстанавливал активность. Полное восстановление активности
наблюдали также при добавлении кальмоду-,лина из мозга свиньи к НАД-
киназе из яиц морского ежа, инактивированной после пропускания через
колонку с ДЭАЭ-сефадек--сом А-25 [28].
Идентичность кальмодулина из растительных и животных тка-лей была
продемонстрирована в опытах по перекрестной активации ферментов [29].
Кальмодулин растительного происхождения активировал фосфодиэстеразу из
мозга быка, и, обратно, кальмо-дулин, полученный из мозга свиньи,
восстанавливал активность НАД-киназы из проростков гороха. Кальмодулины
растительного ж животного происхождения обнаружили сходство и по ряду
других свойств, таких, как молекулярный вес, аминокислотный состав,
способность взаимодействовать с тропонином I, утрачивать .активирующее
действие в присутствии фенотиазина [30].
НАД-киназа из сердца голубя и печени кролика не теряла активности
после ионообменной хроматографии в отличие от фермента из проростков
гороха, однако очищенный, фермент утрачивал прежние свойства
диссоциирующей ферментной системы.
В настоящее время трудно ответить на вопрос о том, почему
•фракционирование на ионообменнике сопряжено с разрушением четвертичной
структуры НАД-киназы из сердца голубя. Можно высказать лишь
предположение, что по аналогии с ферментом мз проростков гороха в
процессе ионообменной хроматографии от НАД-киназы отделяется фактор; в
отсутствие которого последняя утрачивает свойства регуляторной
диссоциирующей ферментной •системы. Принципиальная возможность регуляции
степени ассоциации фермента при помощи специфического фактора показана
для 3-фосфоглицераткиназы из ряда объектов [31]. Авторы работы
установили, что молекулярный вес частично очищенного ¦фермента может
колебаться от 43 000 до 160000 в зависимости от условий гель-фильтрации
через колонки с сефадексом G-100 или G-150, а после фракционирования на
ионообменнике ДЭАЭ-сефа-дексе А-50 фермент утрачивает способность к
