Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
из печени кролика исключало возможность кооперативных эффектов,
опосредованных смещением равновесия между олигомерами разной степени
сложности. Между тем исследование гомогенных а- и p-форм фермента методом
ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы в условиях
протекания ферментативной реакции обнаружило молекулярную гетерогенность
таких препаратов и позволило установить ряд интересных закономерностей.
Четвертичная структура НАД-киназы в условиях протекания
ферментативной реакции
В том случае, когда диссоциирующий фермент представлен равновесной
системой нескольких олигомеров, определение активности фермента при
насыщающих концентрациях субстратов не может дать представления о том,
какие из этих форм каталитически активны. Положение еще больше
усложняется, когда олигомеры различаются по каталитической активности.
Использование метода ультрацентрифугирования (УЦ) в присутствии
субстратов ферментативной реакции, с одной стороны, позволяет решить
вопрос о вкладе каждого из олигомеров в общую активность фермента, с
другой - определить молекулярный вес нативного фермента, а также число и
Мг "активно работающих" форм. Этот метод имеет еще и то преимущество, что
позволяет использовать малое количество фермента - всего 1 мкг
153
[32]. Несмотря на очевидные достоинства метод УЦ не нашел пока широкого
применения. Лишь для органиченного числа ферментов, обладающих
четвертичной структурой, определен молекулярный вес активно работающей
формы [33-38].
Как правило, место локализации фермента в пробирке при проведении УЦ
определяют по активности, а за распределением белка в градиенте сахарозы
не следят. При седимёнтационном анализе НАД-киназы мы определяли место
локализации фермента как по активности, так и по белку. УЦ подвергали
электрофо-ретически гомогенные препараты а- и p-формы НАД-киназы с
молекулярным весом 180 000 и 210 000 соответственно. УЦ проводили как в
присутствии, так и в отсутствие субстратов. По окончании УЦ градиенты
фракционировали на 25-35 фракций и в каждой помимо активности определяли
белок методом с кумас-си G-250 [39]. На рис. 5 представлены кривые
распределения ак-
Рис. 5. Ультрацентрифугнроваиие а- и p-форм НАД-киназы.
А - a-форма фермента, Мг 180 000; Б - p-форма фермента, М, 210 000; I-а
отсутствие субстратов; II - в присутствии субстратов (1.2 мМ НАД, 1,5 мМ
АТФ и 10 мМ MgCb); / - белок фьм); 2- активность (Dbм); стрелкой показано
положение каталазы (Мг 240 000). В случае УЦ в присутствии субстратов
проводили дополнительную инкубацию после фракционирования градиента
тивности и белка в градиенте сахарозы после УЦ. Как можно видеть, при УЦ
формы фермента в отсутствие субстратов (рис. 5. А, I) выявлены два пика
активности, соответствующие белкам с Мг 130000-135000 и 240 000.
Преобладающей по активности оказывается первая форма: на ее долю
приходится до 90% общей
114
активности образца. Вторая форма является минорной по активности.
Обратные соотношения наблюдаются в распределении белка по фракциям
градиента. На минорную по активности форму с Мг 240000 приходится до 95%
белка исследованного образца фермента. Исходя из молекулярного веса
субъединицы а-формы НАД-киназы (33 000), можно считать, что форма с Мг
130 000 является тетрамером. При УЦ в присутствии субстратов (НАД+
+MgATO) картина распределения белка и профиль активности фермента
незначительно изменялись в качественном отношении, но при этом
происходили количественные изменения (рис. 5 А, II). Преобладающей по
активности, как и при УЦ в отсутствие субстратов, остается форма с Мг
130000, однако доля этой формы по белку увеличивается с 5 до 10-15% и,
что особенно важно, общая активность образца при"УЦ в условиях работы
фермента увеличивается примерно в 2,5 раза.
Создается впечатление, что в присутствии субстратов происходит переход
некоторой части фермента из малоактивной или неактивной формы с Мг 240
000 в высокоактивную форму с Мг 130 000. По-видимому, следствием этого
перехода в присутствии субстратов является активация фермента.
Пятикратное увеличение концентрации субстратов не повышает доли активной
формы белка. Значение Мг последней не зависит от ионной силы
используемого буфера. При УЦ в присутствии субстратов, кроме двух
основных форм, можно заметить целый ряд минорных, число которых варьирует
от препарата к препарату. Среди них можно назвать мономер, димер и форму
с Мг 370000. Помимо названных, всегда обнаруживается еще одна минорная,
быстро седиментиру-ющая форма, которая за время УЦ (4-5 ч) доходит до дна
центрифужного стакана. В дальнейшем было выяснено, что появление этой
высокомолекулярной формы обусловлено образованием неспецифических
агрегатов фермента.
Тот факт, что, несмотря на электрофоретическую гомогенность
используемых в опытах по УЦ препаратов НАД-киназы, основная масса белка
или обладает очень низкой каталитической активностью или не обладает
