Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
печени кролика в виде различающихся по молекулярному весу олигомеров,
способных к взаимным переходам. Олиго-
141
меры фермента из скелетных мышц кролика, сердца голубя, а- и P-типов
НАД-киназы из печени кролика формируются из различного числа идентичных
субъединиц с Мг 31000, 45000, 33 000 и 62 000 соответственно. Способность
к ассоциации - диссоциации утрачивается после очистки фермента на
ионообменнике. В дальнейшем изложении мы обсудим возможную причину
влияния ионообменной хроматографии на четвертичную структуру фермента.
Кинетические свойства НАД-киназы
Смещение равновесия между олигомерными формами фермента может обеспечить
быструю и тонкую регуляцию активности фермента в том случае, когда эти
формы сильно различаются по каталитической активности или когда одна или
несколько форм вообще неактивны [21]. Поэтому самым характерным
свойством; диссоциирующих ферментных систем является зависимость удельной
активности от концентрации фермента. Эта зависимость обусловлена
переходами между олигомерами разной степени ассоциации, различающимися по
каталитической активности. Большое число примеров диссоциирующих
ферментов и подробный анализ их свойств приведены в монографии Б. И.
Курганова [21]. Демонстрация зависимости а от [Е]. может служить
убедительным доказательством принадлежности фермента к классу
диссоциирующих ферментных систем. При этом с повышением концентрации
белка можно наблюдать либо повышение, либо понижение удельной активности
в зависимости от того, какая форма данного фермента, ассоциированная или
диссоциированная, обладает более высокой ферментативной активностью [21].
Зависимостью а от [Е]0-характеризовались препараты НАД-киназы из
скелетных мышц кролика (рис. 2). Принимая во внимание то обстоятельство,
что активность определяли в растворе, в условиях, при которых нельзя
исключить взаимного перехода молекулярных форм, не представляется
возможным судить об удельной активности каждой из них. Тем не менее форма
кривой, представленной на рис. 2 А, позволяет констатировать, что
наиболее диссоциированные и наиболее ассоциированные в данных условиях
формы фермента (левая и правая ветви кривой) способны осуществлять синтез
НАДФ с заметно большей скоростью, чем промежуточные формы. Форма кривой а
от [Е]" упрощалась, если ферментный препарат подвергался многократному
замораживанию и оттаиванию в процессе его хранения. Изменение
концентрации субстрата в среде инкубации также изменяло форму кривой а от
[Е]0, что могло быть обусловлено его влиянием на равновесие между
олигомерными формами белка [22].
Зависимость удельной активности от концентрации фермента демонстрировали
также частично очищенные препараты НАД-ки-¦"назы из сердца голубя (рис. 2
Б, кривая /). Подобно ферменту из скелетных мышц кролика НАД-киназа из
сердца голубя про-
142
являла более высокую активность при низком содержании белка в
инкубационной пробе. С повышением содержания белка активность фермента
постепенно понижалась и выходила на плато. Описанный характер изменения
удельной активности сохранялся при внесении в пробу разных количеств
субстрата, что указывало л а меньший вклад последнего в смещение
равновесия между олигомерами НАД-киназы из сердца голубя по сравнению с
изменением концентрации ферментного препарата в инкубационной пробе.
Рис. 2. Зависимость удельной активности от концентрации белка в
инкубационной пробе.
По оси абсцисс - концентрация белка; по оси ординат - удельная
активность
НАД-киназы.
А - НАД-киназа из скелетных мышц кролика; Б - НАД-киназа из сердца
голубя: /-частично очищенный свежевыделенный препарат; 2- тот же
препарат, исследованный через месяц; 3- гомогенный препарат; В - НАД-
киназа из печени кролика (a-форма, Мг 180 000): /-гомогенный фермент без
добавок; 2 - добавлена фракция, содержащая активатор в 5-кратном
количестве по отношению к концентрации фермента; 3 - добавлен БСА в 5-
кратном количестве по отношению к концентрации фермента
Меньшую степень зависимости а от [Е]" наблюдали для постаревшего
(хранившегося в течение месяца пр(и -9° С) препарата (рис. 2 Б, кривая
2). Уменьшение зависимости а от [Е], можно •объяснить, по-видимому,
частичной утратой способности к ассоциации при старении ферментного
препарата. В то же время удельная активность эле'ктрофоретически
гомогенных препаратов
V
143
не зависела от концентрации фермента в инкубационной пробе, что можно
рассматривать в качестве еще одного . доказательства полной утраты таким
ферментом способности к ассоциации при повышении концентрации белка
ферментного препарата в среде инкубации.
Как можно было ожидать, частично очищенные препараты НАД-кииазы из
печени кролика тоже обнаруживали зависимость а от [Е] о, тогда как
удельная активность гомогенных препаратов не зависела от концентрации
фермента (рис. 2 В, кривая /). Отсутствие такой зависимости, по-видимому,
