Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
при повышении концентрации •белка в растворе. Однако нельзя было
полностью исключить возможности перехода мономера НАД-киназы в
присутствии субстратов реакции в более ассоциированное состояние. Для
решения поставленного вопроса провели иммобилизацию фермента и показали,
что иммобилизованный мономер способен осуществлять синтез НАДФ. Последнее
обстоятельство явилось доказательством ;гого, что мономер обладает
каталитической активностью и, по-видимому, не способен в присутствии
субстратов к ассоциации.
Возвращаясь к частично очищенным препаратам НАД-киназы, ^рассмотрим
вопрос о типе взаимных переходов олигомерных форм фермента. Хорошо
известно, что для быстро диссоциирующих •ферментных систем форма кривой
зависимости v от [S]" определяется концентрацией фермента только в
реакционной среде, но не в исходном растворе. Для медленно диссоциирующей
системы, кинетическое поведение которой зависит от состояния равновесия
между олигомерами в исходном растворе фермента, решающее значение
приобретает его "предыстория", т. е. условия хранения ферментного
препарата и его концентрация до внесения в реакционную среду [21].
Результаты опытов по определению зависимости удельной активности
фермента от его концентрации, при проведении которых •фермент разводили
непосредственно перед началом инкубации, а также влияние концентрации
фермента на ход кинетических кривых V от [S]. указывают на возможность
достаточно быстрых по сравнению со скоростью НАД-киназой реакции
процессов диссоциации.
При исследовании влияния разведения на удельную активность НАД-
киназы. из скелетных мышц кролика было отмечено любопытное явление -
колебание активности в разведенных растворах фермента [25]. Если
ферментный препарат, хранившийся при -15° С, разморозить, развести
буфером и выдержать при 0°С определенное время, до добавления в среду
инкубации, то активность НАД-киназы изменяется во времени. Колебания
наблюдали
146
на протяжении двух часов после разведения. В размороженном, но не
разведенном растворе колебаний активности при выдерживании его при 0° С в
течение четырех часов не наблюдали. В случае преинкубации в присутствии
ЛАД и АТФ (без Mg2+) колебания ферментативной активности прекращались.
При хранении в течение месяца при -9° С частично очищенных препаратов
из сердца голубя также наблюдали периодические спонтанные колебания
ферментативной активности.
В процессе хранения препарата происходит попеременное повышение и
понижение ферментативной активности. Амплитуда, колебаний зависит от
концентрации белка в хранящейся пробе* Для неразведенного фермента
отмечено плавное изменение активности на протяжении всего срока хранения.
Для разведенного в 100 раз препарата характерны резкие скачки
ферментативной активности. Если хранить такие препараты в присутствии
субстрата (1 мМ НАД), го разведенный препарат НАД-киназы ведег себя при
хранении подобно неразведенному [24].
Спонтанные колебания активности, фермента во времени после разведения
были описаны для препаратов белков актомиозино-вого комплекса,
креатинкиназы и некоторых других ферментов [26, 27]. По мнению авторов, в
основе отмеченных колебаний лежат периодические синхронные
конформационные изменения молекул белка.
Мы склонны объяснить-обнаруженные при хранении препаратов НАД-киназы
из скелетных мышц кролика и сердца голубя: колебания ферментативной
активности медленными процессами, ассоциации - диссоциации олигомерных
форм фермента, обладающих различной каталитической активностью. В
разбавленных растворах амплитуда колебаний увеличивается. Добавленные
субстраты прекращают колебание активности, очевидно, фиксируй имеющееся в
системе в момент их добавления равновесие между олигомерными формами
фермента или стабилизируя одну из олигомерных форм.
Таким образом, изучение четвертичной структуры и некоторых,
кинетических свойств НАД-киназы из скелетных мышц кролика, сердца голубя
и печени кролика позволило обнаружить большое сходство между этими
ферментами. Анализ изложенного выше-материала, на наш взгляд, убедительно
свидетельствует в пользу принадлежности всех трех НАД-киназ к
диссоциирующим ферментным системам, регуляция активности которых может
осуществляться путем смещения равновесия между олигомерными формами,
обладающими различной каталитической активностью. При этом обнаружены
некоторые различия между ферментом из скелетных мышц кролика и сердца
голубя в регуляции ферментативной активности. Из данных кинетических
исследований препарата НАД-киназы из скелетных мышц кролика следует, что
смещение равновесия между олигомерными формами происходит при изменении
концентрации субстратов, pH среды инкубации, в присутствии цАМФ или при
добавлении разных концентраций
147
фермента. В двух последних случаях удавалось наблюдать нормализацию
зависимости v от [S]0, которая из сложной превращалась в гиперболическую,
что могло служить указанием на смещение равновесия в сторону одной из
