Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
совсем, может ставить под сомнение принадлежность этого белка к
собственно НАД-киназе. Для решения возникшего вопроса проводили повторное
УЦ неактивного белка. С этой целью из нескольких пробирок объединяли
фракции, содержавшие неактивный белок, и после соответствующего
разведения и концентрирования около 40 мкг белка подвергали повторному
УЦ. Снова обнаруживали активйую форму с Мг 130 000.
Полученный результат дает основание полагать, что неактивный белок
представляет собой потенциально активную форму фермента, .способную в
определенных условиях переходить в каталитически активную.
Мы попытались обнаружить активную тетрамерную форму методом
электрофореза в градиенте Г1ААГ. Для повышения доли активной формы
гомогенный препарат фермента a-типа с Мг 180000 инкубировали с
субстратами в течение 2 сут при +4° С,
после чего подвергали электрофорезу. Оказалось, что электрофо-реграмма
белка после такой обработки не изменилась и демонстрировала всего одну
белковую полосу с Мг 180 000; тетрамера обнаружить не удалось. В то же
время анализ этого же препарата методом УЦ показал значительный переход
неактивной формы фермента в активную, тетрамерную. По-видимому, активная
форма отличается большой лабильностью и при электрофорезе может
переходить в неактивную.
Исследовали влияние каждого из субстратов и их компонентов (НАД, Mg-
АТФ, АТФ, MgCl2) на структуру фермента при УЦ. Оказалось, что решающее
влияние на четвертичную структуру фермента оказывает Mg-АТФ. Общая
активность образца после УЦ в присутствии НАД или АТФ не изменялась по
сравнению с активностью, определенной после УЦ в отсутствие субстратов,,
тогда как в присутствии только Mg-АТФ картина распределения; активности и
белка аналогична наблюдаемой при УЦ в полной системе (НАД+Mg-АТФ). В
обоих последних случаях доля активной формы составляет 15% общего белка
фермента.
Открытым остается вопрос о том, обладает ли основная побелку форма
фермента с Мг 240000 некоторой активностью. Скорее всего эта форма совсем
неактивна, а незначительная активность, обнаруживаемая во фракции
градиента данной формой,, обусловлена переходом некоторой части белка из
неактивной; в активную форму с момента фракционирования градиента
сахарозы но окончании УЦ до определения активности во фракциях.
При анализе методом УЦ другой формы a-типа НАД-киназы с меньшей
удельной активностью (Мг 150 000) было доказано, что-она также ведет себя
как система, состоящая из активной и неактивной форм. Активная форма, как
и в случае олигомера с Мг 180 000, имеет тетрамерную структуру.
Частично очищенные препараты НАД-киназы, подвергнутые УЦ в присутствии
субстратов, обнаруживают в качестве основной каталитически активной все
ту же форму с Мг 130 000.
Полученные результаты убедительно свидетельствуют, что основной, если
не единственной активно работающей формой фермента a-типа как в
гомогенных, так и частично очищенных препаратах является тетрамерная
форма (см), которая, по-видимому находится в равновесии с неактивной
формой.
ч При УЦ препарата НАД-киназы p-типа были получены аналогичные
результаты. Электрофоретически гомогенный препарат {Мг 210 000) также
разделяется при центрифугировании на активную (с Мг 120000-130 000) и
неактивную (с Мг 240 000) формы. Но,по сравнению с ферментом a-типа
большая часть фермента p-типа присутствует в активной форме: в отсутствие
субстратов на долю этой формы приходится 15% белка, а в их присутствии -
40%. При этом наблюдается повышение активности исследуемого образца
фермента в 2,5 раза.
Так как молекулярный вес субъединицы p-типа НАД-киназы равен 62 000,
активная форма является димером. Помимо актив-
156
ной димерной формы в препарате фермента р-тИпа обнаруживается еще одна -
с Мг 190 000 (тример), доля которого при УЦ в присутствии субстратов
уменьшается (см. рис. 5 Б, II).
Таким образом, на основании результатов, полученных при исследовании
электрофоретически Гомогенных препаратов а- и р-ти-пов НАД-киназы с
помощью метода УЦ в градиенте плотности сахарозы, можно сделать следующее
заключение: (1) гомогенный,, по данным электрофореза, фермент при УЦ
разделяется на две основные формы - каталитически активную и неактивную.
(2) В присутствии субстратов (НАД и Mg-АТФ) наблюдается переход фермента
из неактивной формы в каталитически активную. При этом в активную форму
может перейти только часть неактивного фермента. В случае a-типа НАД-
киназы доля эта незначительна и составляет 15%, для p-типа фермента
показан переход в активную форму 40% неактивного белка. (3) Переход
большего-количества белка в активную форму в присутствии субстратов
сопровождается повышением общей активности образца фермента. (4)
Каталитически активными формами а- и p-типов НАД-киназы являются тетрамер
и димер соответственно.
Можно думать, что разные значения удельной активности, полученные для
отдельных гомогенных форм а- и p-типов (см. табл. 1), обусловлены
