Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
различным содержанием в них каталитически, активной формы.
Механизм перехода неактивного гекса- или тетрамера в активный тетрамер
(a-форма) или димер (p-форма) неизвестен. Непонятной остается причина
лишь частичного перехода неактивной формы в активную. Нам не удалось
повысить долю активной формы такими воздействиями, как продолжительная
инкубация, в присутствии субстратов, или увеличение в 5 раз концентраций
НАД и Mg-АТФ. •
Мы не нашли в доступной нам литературе аналогичных данных о разделении
при УЦ в присутствии субстратов олигомерных белков на каталитически
активные и неактивные формы. Возможно, что отсутствие подобных
результатов объясняется тем* что при исследовании четвертичной структуры
ферментов методом УЦ в условиях протекания ферментативной реакции место
локализации фермента в центрифужной пробирке определяли исключительно по
активности. По этой причине присутствие неактивной белковой фракции могло
остаться просто незамеченным. 'Между тем нельзя, по-видимому, полностью
исключить возможности существования и для -других ферментов каталитически
активной и неактивной форм. Высказанное соображение можно
проиллюстрировать следующим примером. Из данных литературы-известно, что
молекулярный вес гомогенного препарата НАД-киназы из печени голубя,
определенный методом гель-фильтрации, равен 270 000 [19]. Мы
анализировали методом УЦ в присутствии субстратов частично очищенные
препараты фермента из печени голубя и не смогли обнаружить каталитически
активной формы с таким высоким молекулярным весом. Однако 60% активности
157-
приходилось на форму с Мг 133 000. Эти результаты указывают на то, что в
данных условиях каталитически активной формой 'фермента из печени голубя
является, по-видимому, тетрамер (напомним, что Мг субъединицы фермента
равен 34000).
Как и следовало ожидать, для диссоциирующих ферментов молекулярный
вес активно работающей формы зависел от количества взятого на анализ
белка. Так, при низких концентрациях фермента (<12 мкг/мл)
фосфофруктокиназа (ФФК) из мышц кролика представлена в основном
мономером; при высоких кон-. центрациях фермента активно работающей
формой фермента становится тетрамер [33]. При всех условиях (в отсутствие
субстратов, при относительно низких концентрациях фермента и др.)
работающая форма ФФК исходно присутствует в растворе и находится в
равновесии с другими формами фермента. В присутствии субстрата ее доля
увеличивается, и она становится преобладающей в системе [34, 40]. В этом
отношении ФФК напоминает НАД-киназу из печени кр'олика, препараты которой
при анализе в отсутствие субстратов обнаруживают незначительное
количество активной формы. Доля последней увеличивается при УЦ в пол-¦ной
системе. Однако сходство это относительное и полной аналогии между
поведением обоих ферментов провести нельзя уже потому, что олигомерное
состояние активной формы ФФК может меняться при изменении концентрации
исследуемого образца, тогда как гомогенные препараты НАД-киназы, как уже
неоднократно подчеркивалось, утратили способность к такого рода
переходам. Кроме того, мы ничего не знаем о существовании каталитически
неактивных форм ФФК.
Заключение
Вся совокупность изложенных данных указывает на существование достаточно
сложной, многоступенчатой системы регуляции активности НАД-киназы в
исследованных животных тканях. Регуляция ферментативной активности может
осуществляться на разных уровнях. Это прежде всего регуляция на уровне
субстратов и их аналогов. Вопрос о такого рода регуляции достаточно полно
освещен в литературе. Показано, что Mg-АТФ играет более важную роль в
регуляции НАД-киназной активности, чем НАД [41-43], и поэтому именно
концентрация АТФ может явиться лимитирующим фактором в синтезе НАДФ в
организме. Хорошо известно, что НАД-киназа почти из всех источников
ингибируется восстановленными формами пиридиновых нуклеотидов НАДН и
НАДФН [44, 19, 45-48] и аналогами АТФ: АДФ [46, 47, 49], АДФР,
аденозином, 2'-, 3'- и 5' АМФ [50]. Свободные АТФ4- и Mg2+ также
ингибируют фермент [51]. Предполагают, что инги-биция НАДН и НАДФН может
лежать в основе регуляции активности фермента in vivo. Расчеты показали,
что при физиологических концентрациях НАДН и НАДФН в печени крысы
активность НАД-киназы может быть заторможена на 80 % [43].
158
В обзоре основное внимание было уделено анализу возможных механизмов
регуляции ферментативной активности на уровне четвертичной структуры и
показана целесообразность и необходимость сравнительного изучения свойств
частично очищенного и гомогенного фермента для выявления многообразных
способов регуляции НАД-киназы. Было показано, что фермент в скелетных
мышцах кролика, сердце голубя и печени кролика представлен множественными
формами и проявляет свойства диссоциирующей ферментной системы. Приведены
данные о наличии в ткани печени двух типов фермента (а и р),
различающихся по субъ-единичному составу, каталитической активности и
