Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
с отверстием для заполнения ячейки и передачи давления.
Б - оптическая кювета высокого давления (изготавливается из немагнитной
нержавеющей стали): 1 - цилиндрическая полость для установки реакционной
ячейки; 2 - запорная крышка; 3 - канал для подключения к гидравлическому
насосу высокого давления; 4 - магнитопровод; 5 - съемный соленоид для
запуска реакции; 6 - штуцер для подключения к ультратермостату; 7 -
кварцевые цилиндрические окна; 8 - гайкн для крепления окон; 9 -
тефлоновые уплотняющие кольца - прокладки
169
плексигласа и ее объем составляет около 2,5 мл. Снаружи в дне ячейки
имеется круглое углубление, в котором закрепляется и изолируется от
внешней среды стальной диск (2). Сверху ячейка закрывается крышкой (5) с
конической внутренней поверхностью и отверстием. Для проведения опыта в
углубление миниатюрной пластмассовой чашечки (3) микрошприцом вводят
строго дозированное количество (например, 10 мкл) одного из главных
реагентов - фермента или субстрата. Чашечка имеет полированный бортик,
которым она прижимается ко дну ячейки, как показано на рис. 1. К наружной
поверхности дна чашечки приклеен плоский цилиндрический постоянный магнит
(4) (диаметром примерно 5 мм, толщиной 3 мм), который, притягиваясь к
диску (2), удерживает чашечку в прижатом ко дну ячейки положении вплоть
до сигнала о начале реакции. Для улучшения контакта чашечки с дном ячейки
контактные поверхности предварительно смазывают очень тонким слоем
инертной смазки (например, вазелиновым маслом).
После установления заполненной чашечки на место ячейку споласкивают
водой (избыток которой отсасывают шприцем с пластиковым наконечником) и
заполняют реакционной средой со вторым необходимым реагентом. Среду
наливают с небольшим избытком, так, чтобы образовался выпуклый мениск, и
закрывают ячейку крышкой (5). Коническая форма крышки и отверстие
помогают полностью удалить из ячейки пузыри воздуха. В заключение сборки
ячейки отверстие заклеивают с помощью вазелиновой смазки небольшим
лоскутом гибкого тонкого полиэтилена.
Собранную ячейку вставляют в предварительно заполненную водой
цилиндрическую полость V) в кювете, которая показана на рис. 1 Б, плотно
завинчивают верхнюю крышку (2), с помощью гибкой стальной трубки
подключают кювету через канал (3) к поршневому гидравлическому насосу и
устанавливают в спектрофотометр. На выступающий магнитопровод (4)
надвигают соленоид (5), на штуцера (б) надевают резиновые шланги от
ультратермостата. Кварцевые окна (7) в стальных оправах (S) с помощью
тефлоновых колец (9) герметизируют кювету. Крышку кюветного отделения
спектрофотометра закрывают и поднимают давление. Реакция при этом не
запускается, и поэтому можно выждать столько времени, сколько необходимо
для выравнивания температуры на заданном уровне. Содержимое ячейки
находится все это время под заданным гидростатическим давлением, которое
передается от заполняющей кювету воды через гибкий полиэтилен,
закрывающий отверстие в ячейке. Если после этого заполнения ячейки в ней
не осталось пузырей воздуха, то полиэтилен не продавливается и не
пропускает воду в ячейку.
Для запуска реакции соленоид с помощью кнопочного выключателя
кратковременно (-0,5 с) подключается к источнику переменного тока
(регулируемого автотрансформатора), напряжение которого должно быть
подобрано так, чтобы (при данном соленоиде) переменное магнитное поле
отрывало от дна ячейки
170
чашечку с приклеенным магнитиком и заставляло ее совершить достаточное
для полного перемешивания среды число оборотов.
Регистрацию оптйческой плотности на избранной длине волны начинают за
некоторое время (10-20 с) до включения соленоида, и это дает возможность
точно зафиксировать на диаграммной бумаге момент начала реакции (а также
проконтролировать отсутствие реакции до этого момента из-за подтекания
реагента из чашечки) (рис. 2).
Рис. 2. Кинетика лактатдегидрогеназной реакции под давлением 1000 атм.
"Спекорд УФ-ВИЗ", 340 нм, 25°С; 0,2 М трис-ИСХ буфер: pH 7,5, 10 мМ ди-
тиоэритритол, 1 мМ ЭДТА, 0,4 мкг/мл ЛДГ, 0,8 мМ пируват Na, 0,16 мМ НАДН.
Надписи Г, 3' и 10' указывают на экспозицию фермента под давлением 1000
атм до начала реакции (время в минутах)
Описанное устройство позволяет варьировать условия проведения
эксперимента. Так, например, помещая в чашечку субстрат, а фермент вводя
с самого начала в раствор, заполняющий ячейку, можно выдерживать нужное
время фермент под давлением без контакта с субстратом. Если при этом
активность фермента изменяется, то после начала реакции сразу выясняется,
оказывает ли данный субстрат стабилизирующее действие (см. с. 173).
Устройство дает возможность исследовать квазирелаксацион-ную кинетику
при быстром (~5 с) повышении или понижении давления в ходе реакции.
Правда в таких опытах относительно быстрое изменение давления приводит и
к температурному скачку, но это неустранимая особенность релаксационных
опытов: как
