Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
происходит денатурация фермента. Активность мно-госубъединичных ферментов
может падать из-за диссоциации на субъединицы под влиянием
гидростатического давления, быстро возрастающего в полосе по мере ее
седиментации ко дну ячейки [9, 10]. Все эти факторы, искажающие
правильный ход опытов, следует уметь распознавать и принимать меры для их
устранения.
-CCs
О
а-
+
\
С)
5-
ь
В-
г У
/у. S уу
1/ ¦ 1
1
Рис. 3. Условие стабилизации полосы с ферментом
посредством градиента плотности.
1 -- градиент плотности и плотность фермента в полосе; 2 - градиент
(линейный) плотности и плотность низко-молекулярного вещества
(подробности в тексте); 3 - суммарный градиент
плотности и плотность. А - градиенты, Б -
интегральные кривые
180
Измерение коэффициента седиментации
Измерение коэффициента седиментации в опытах по методу САФ можно
произвести разными способами. Математически строгие подходы описаны в [8,
11]. Мы ограничимся здесь указанием на два приближенных способа, широко
использующихся и приводящих к вполне удовлетворительным результатам.
Способ разностных кривых [7]. Границы седиментации на рис. 2 А и 2 Б
являются функциями координаты г и параметра t - момента времени, когда
производилось данное сканирование At {г). Разностная кривая
ц+м (г) = Al+At(r) -А, (г),
полученная вычитанием в каждой точке г двух последовательно
просканированных с интервалом времени At границ, характеризует накопление
продукта за этот интервал времени (если At достаточно мало, чтобы
седиментацией и диффузией продукта можно было пренебречь). Предполагая,
что каждая молекула фермента в любом месте полосы реагирует с субстратом
с одинаковой скоростью, легко заключить, что максимум разностной кривой
совпадает с максимумом распределения фермента в полосе в момент времени
t+Mj2. Поэтому коэффициент седиментации вычисляется по обычной формуле
s=Alnr/o2Af из графика зависимости In г от t [1, 2].
Способ деления границы пополам [8]. В тех случаях, когда границы
седиментации достаточно симметричны, максимуму полосы (координате f(t))
соответствует полувысота границы. Если снизу и сверху граница имеет
горизонтальные плато, полувысота есть просто половина расстояния между
плато [8]. Если же симметрия границы почему-либо нарушена и одно или оба
плато отсутствуют, то можно прибегнуть к "способу прозрачной линейки"
[2], найти середину квазилинейного участка границы и принять координату
этой точки за искомую координату г. Ошибка в величине 5 при этом,
конечно, возрастает, но остается все же в пределах ±5% (при том условии,
что все перечисленные выше требования к проведению опыта удовлетворены).
Неправильное определение s при чрезмерной
активности фермента в полосе
Грубая ошибка может быть допущена при измерении s, если концентрация
активного фермента столь велика, что где-то внутри полосы концентрация
субстрата падает до такого уровня, когда уже не фермент, а субстрат
начинает лимитировать скорость реакции. Это деформирует границу
седиментации таким образом, что во фронтальной части полосы граница на
ленте самописца ультрацентрифуги круто поднимается вверх, а затем полого
выходит на нижнее плато. Точка перегиба с координатой t оказывается
смещенной вперед относительно вершины кривой распреде-
181
ления фермента в полосе и соответственно завышена величина коэффициента
седиментации. Эта погрешность может составлять десятки процентов.
Необходимо, однако, указать на работу [12], теоретически и
экспериментально расширившую рамки метода САФ в область больших (до 1
мг/мл) концентраций активного фермента. Это открывает новые возможности
для изучения концентрационной зависимости ассоциации - диссоциации и
инактивации много-субъединичных ферментов (см. также [13]).
Ферменты сопряженной системы
При выборе сопряженной системы для опытов по методу САФ необходимо
обеспечить выполнение двух условий. Во-первых, ферменты такой системы
должны иметь заметно меньший коэффициент седиментации по сравнению с
изучаемым ферментом. Так, например, при исследовании пируваткиназы, у
которой s=9,7 s, в качестве сопряженного фермента можно взять
лактатдегидроге-назу с 5=7,0 5, благодаря чему она не будет опережать
седиментацию пируваткиназы. Во-вторых, сопряженные ферменты следует брать
в такой высокой концентрации, чтобы они ни в коем случае не лимитировали
суммарную реакцию.
Техника эксперимента
На рис. 1 показан двухсекторный сердечник для полосового> опыта.
Сердечник выполнен из эпоксидной смолы с древесным углем в качестве
наполнителя, придающего сердечнику добавочную прочность и черный цвет.
Боковые круглые отверстия представляют собой колодцы с дном и вмещают до
20 мкл жидкости. Узкие и мелкие канавки соединяют колодцы с обычными
сквозными секториальными прорезями (так называемыми "секторами"). Секторы
