Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Направление седиментации
Рис. 2. Два типа седиментационных диаграмм в опытах по методу САФ с
митохондриальной Н+АТФазой из сердца быка.
А - совмещенные сканы границ седиментации в опыте с сопряженной системой
и окислением НАДН; Б - опыт с рН-индикатором "нейтральный красный"; В, Г
- графики для вычисления коэффициентов седиментации по методу разностных
кривых (2) и по полувысоте границ (7), соответствующие опытам А и Б
Случай 2: оптическая плотность среды возрастает. Это может иметь
место, если, например, зона с лактатдегидрогеназой седиментирует через
среду, содержащую достаточно много лактата и НАД+, в результате чего
лактат окисляется до пирувата, а НАД+ восстанавливается до НАДН. В таком
опыте ячейку можно снаряжать так же, как в случае 1, но лучше вводить
лактат и НАД+ в оба сектора, чтобы более уверенно фиксировать базовый
уровень.
Седиментационные диаграммы в этом случае имеют в принципе тот же вид,
что и на рис. 2 А, но как если бы седиментация происходила справа налево.
178
Случай 3: фермент-субстратная реакция приводит к изменению pH среды.
Пример - гидролиз АТФ митохондриальной Н+АТФазой. Изменение pH среды
можно с помощью подходящего индикатора преобразовать в изменение
оптической плотности в области длин волн, характерных для данного
индикатора. На рис. 2 Б приведена последовательность границ седиментации
полосы Н+АТФазы в присутствие субстрата Mg-АТФ и рН-индика-тора
"нейтральный красный". В обоих секторах полосовой ячейки находились и
субстрат, и индикатор.
Для таких исследований рН-индикатор должен обладать двумя
обязательными качествами: во-первых, ие влиять на активность и физико-
химические свойства фермента; во-вторых, оптическая плотность реакционной
среды с этим индикатором должна уменьшаться или возрастать при каждом
ферментном акте ("обороте" фермента) на одну и ту же величину при всех
значениях pH в седиментирующей полосе фермента.
Подобрать такой рН-индикатор весьма не просто. Кроме того, при
высокой скорости вращения ротора любой индикатор неизбежно во время опыта
перераспределится в ультрацентрифуж-ной ячейке в соответствии со своими
коэффициентами седиментации и диффузии, что в большей или меньшей степени
исказит абсорбционную седиментограмму. Все это побуждает применять в
опытах с ферментами, которые сами не изменяют оптической плотности
реакционной среды, сопряженные фермент-субстратные системы, подобранные
так, чтобы выполнялись оба указанные условия. Пример такой системы будет
приведен в разделе "Некоторые результаты применения метода САФ".
Успешное проведение экспериментов по САФ требует соблюдения ряда
предосторожностей.
Стабильность полосы. Прежде всего необходимо обеспечить стабильность
полосы с ферментом. Чтобы избежать появления конвекций, которые исказят
форму границы и сделают невозможным измерение коэффициента седиментации,
должно быть соблюдено условие [7], связывающее суммарный градиент плот-
/ др \
ности в седиментирующеи полосе (-1 с его составляющими:
самогенерирующимся градиентом плотности низкомолекулярного вещества,
диффундирующего из реакционной среды в полосу
-с ферментом ,и градиентом плотности самого фермента
в этой полосе
(П
-зн-н.-*-(•?).>*
Физический смысл этого условия, графически изображенного на рис. 3 А,
становится понятным из соответствующих интегральных кривых на рис. 3 Б:
суммарная плотность раствора нигде в ячейке не должна убывать с
увеличением расстояния г от оси враще-
17*
ния ротора. В противном случае фермент будет "проваливаться" на переднем
крае полосы и возникнет конвекция. Чтобы избежать этого, надо правильно
выбрать наслаиваемый объем и концентрацию фермента, а также концентрацию
низкомолекулярного вещества.
Постоянство скорости реакции. Следующим важным требованием является
постоянство скорости ферментативной реакции в пределах всей полосы.
Если реакция необратима, то удовлетворить этому требованию с
достаточной точностью можно взяв такие концентрации субстрата и фермента,
чтобы при продвижении полосы концентрация
субстрата [S] уменьшалась менее чем на 10%. Ограничившись такой глубиной
реакции, в случае кинетики Михаэлиса-Ментен легко
рассчитать, что при [S]0> "ЗКm скорость реакции на хвосте полосы будет
менее чем на 3% ниже скорости на фронте, что в ряде случаев вполне
допустимо.
Для обратимой реакции положение усложняется тем, что на хвосте
полосы, в отличие от переднего края, присутствует определенное количество
продукта, и в результате скорость реакции может заметно снизиться Чтобы
этого не произошло, в среде создают очень высокую начальную концентрацию
субстрата, например 20 Кт [7].
Скорость реакции может уменьшаться в пределах полосы, если продукт
является сильным ингибитором, или возрастать, если ингибирующими
свойствами обладает находящийся в избытке субстрат.
Наконец, скорость реакции понижается со временем, когда в ходе опыта
