Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
кривых.
Как уже отмечалось, в сопряженной системе лимитирующим скорость
реакции фактором должен быть во всей полосе только исследуемый фермент.
Поэтому в таких экспериментах желательно проверять соблюдение этого
условия, проведя серию опытов по методу САФ, постепенно повышая
концентрацию второго фермента (и третьего, если таковой участвует в
сопряженной системе): в области, где скорость реакции лимитируют
вспомогательные ферменты, значения коэффициента седиментации будут
возрастать и стремиться к "насыщению", т. е. к коэффициенту седиментации
исследуемого фермента [7].
В разделе "Теоретические и экспериментальные основы" было указано,
что для получения правильных результатов важно, чтобы скорость реакции
оставалась постоянной во времени в течение всего опыта. Для проверки
следует построить график накопления продукта со временем и убедиться в
его прямолинейности от начала до конца опыта. При любой постановке
эксперимента для построения графика надо вычислить площади разностных
кривых или промежутков между последовательно просканированными границами
седиментации (после перерисовки их с приведением к единому началу отсчета
времени - см., например, [9]); возрастающую сумму этих площадей
откладывают по оси ординат против соответствующих моментов времени на оси
абсцисс. Такие расчеты и построения удобнее вести, если сканирование
проводить через постоянные интервалы времени (2-8 мин в за-
184
виеимоети от скорости вращения ротора и скорости седиментации фермента).
Если график оказывается искривленным к оси времени, то имеет смысл
повторить опыты при других скоростях вращения ротора: гидростатическое
давление в ячейке ультрацентрифуги лропорцонально квадрату угловой
скорости [16], и поэтому, если имеет место увеличение изгиба графика при
большей скорости, то это указывает на диссоциацию фермента на неактивные
(или менее активные) субъединицы [10].
В заключение эксперимента, когда после всех перечисленных
предосторожностей и проверок вычислено значение коэффициента седиментации
Бнабл, в него необходимо внести поправки на вязкость, плотность и
температуру раствора субстратов в опыте по известной формуле
( Ъ \ ( Ч \ 1 ~ Угор20.w
S.20.I" - (r)набл I II J I Тг
V Т)го / w \ f]w It 1 - V/pf
где главные поправочные члены - отношение вязкости воды (ш) при
температуре опыта к вязкости при 20° С и относительная вязкость раствора
при температуре опыта; меньшую роль играет поправка на плотность, где
рго.ю плотность воды при 20° С, pt - плотность раствора при температуре
опыта, V20 и V* - парциальный удельный объем фермента при 20° С и_при
температуре опыта соответственно (если известно значение V при какой-либо
температуре t, то при t\ объем Vt, = Vf.O + Ю'4(^а *i)}-
Примеры экспериментов со сложными ферментами. Изучение сложных
ферментов с помощью метода САФ позволяет в некоторых случаях выяснить
роль четвертичной структуры в их каталитической функции.
Тейлор с сотр. [17] применяли метод САФ для исследования
пируваткарбоксилазы (ПКК) из печени цыпленка и крысы. Опыты проводили в
сопряженной системе с малатдегидрогеназой. Для создания градиента
плотности реакционная среда содержала 50% D20. Скорость вращения ротора
составляла 52 000 об/мин.
Были обнаружены две активные формы ПКК цыпленка с коэффициентами
седиментации 16 S и 22 S. Интересно отметить, что обе формы наблюдались
одновременно, но без твердых указаний на наличие обратимой реакции
ассоциации - диссоциации между ними. Добавочные опыты с обычной
скоростной седиментацией при большой концентраци белка позволили авторам
заключить, что 22 S компонента не является артефактом из-за возможной
перегрузки полосы. В работе делается вывод, что 16 S - это тетрамеры, а
22 S - октамеры 7 S субъединиц.
Пируваткарбоксилаза из печени крысы также седиментирова-ла двумя
активными формами, но в разных средах: в присутствии ацетил-СоА с
s=16,3S, а без этого активатора - с 5=12,3 S. Переход из 16 S- в 12 5-
форму происходил и при увеличении ион-
185
ной силы (КНСОз). Авторы полагают, что быстрая форма пред* ставляет собой
тетрамеры, а медленная - димеры.
Еще один интересный результат этой работы заключается в том, что в
отсутствие ацетил-СоА ни одна форма ПКК из печени цыпленка не обладает
активностью, в то время как оба олигомера ПКК крысы (и даже ее мономер)
активны, хотя и в меньшей мере, чем при наличии активатора.
Важные данные получены методом САФ для фосфофрукто-киназы (ФФК) из
мышцы кролика [5, 18]. Опыты проводили в сопряженной системе с
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена-зой+триозофосфат изомеразой, а также с
рН-индикатором "крезол красный". В первом случае удельная активность ФФК
составляла 190 ед./мг, во втором - 90 ед./мг. Скорость вращения ротора
была 60 000 об/мин. Коэффициент седиментации активной ФФК s2o,a.= 12,2S в
тех и других опытах [18]. В следующей работе [5] было, кроме того,
