Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н.
Белозерского МГУ)
Коэффициент седиментации фермента определяют обычно в аналитической
ультрацентрифуге методом скорости седиментации [1. 2]. Для этих опытов
необходимо располагать примерно 1 мг фермента довольно высокой степени
чистоты - не менее 90%. Концентрацию белка даже в ультрацентрифуге с
фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой с трудом удается
снижать до -50 мкг/мл, и поэтому в ряде случаев для экстраполяции
коэффициента седиментации к бесконечному разбавлению приходится проводить
серию опытов с различными концентрациями.
В 1963 г. Коэн [3] предложил наслаивать в границеобразующей ячейке
клапанного типа небольшой объем раствора фермента на более плотный
буферный раствор с субстратами и регистрировать седиментацию зоны,
содержащей фермент. Если в результате ферментативной реакции изменяется
оптическая плотность раствора, то с помощью абсорбционной оптики можно
даже в грубом экстракте наблюдать седиментацию одного лишь интересующего
нас фермента: в месте его встречи со своими субстратами оптическая
плотность будет либо возрастать, либо уменьшаться. Таким образом, для
определения коэффициента седиментации нет необходимости добиваться
высокой степени гомогенности ферментного препарата.
Особый интерес придает этому методу его главная особенность -
непрерывная фермент-субстратная реакция в течение всего опыта в
ультрацентрифуге, из-за чего метод и получил название "седиментация
активного фермента" (САФ). Поэтому коэффициент седиментации, определенный
в таких опытах, отражает динамическое состояние реагирующего фермента и
может отличаться от коэффициента седиментации, измеренного в обычных
опытах без субстрата [5].
В дальнейшем САФ стали проводить в ячейках, разработанных для
"полосового" аналитического ультрацентрифугирования [4, 6] в
ультрацентрифугах с фотоэлектрической абсорбционной сканирующей системой
[2]. Эти ячейки позволили уменьшить необходимое количество фермента до
долей микрограмма, а сканирующая система существенно упрощает обработку
седиментаци-онных диаграмм.
176
Наряду со многими достоинствами метод САФ может приводить к таким
ошибкам, которые несвойственны обычным методам седиментационного анализа
и которые могут происходить из-за неправильной постановки эксперимента
[7, 8] или из-за особых свойств изучаемого фермента [9].
В этой статье мы кратко изложим теоретические и экспериментальные
основы метода САФ и опишем главные источники возможных артефактов.
Теоретические и экспериментальные основы
В обычном зональном препаративном ультрацентрифугировании стабильность
наслоенной зоны с биополимерами обеспечивается предсозданным градиентом
плотности. Наиболее широко для этого применяют сахарозу.
В методе САФ тонкий слой забуференного раствора фермента в начале
опыта (при скорости вращения ротора 1000- 2000 об/мин) наслаивается на
однородный раствор субстратов-в том же буфере, но с добавленным
низкомолекулярным веществом. Стабилизация достигается также с помощью
градиента плотности, но в этом случае он образуется уже после наслоения
благодаря диффузии низкомолекулярного вещества в слой - "полосу" с
ферментом. Для эффективного протекания этого процесса самогенерации
градиента в качестве низкомолекулярных веществ применяют нейтральную
соль, D2O, глицерин и т. п., но не сахарозу, у которой для таких опытов
недостаточно велик коэффициент диффузии.
Ультрацентрифугирование с самоге-нерирующимся градиентом плотности в
отличие от зонального было названо "по- рис j Двухсекторный сер-лосовым"
(band), и так же называ- дечник типа I для полосе-ются специальные
сердечники к анали- вого аналитического ультра-тическим ячейкам [4, 6].
Чаще всего центрифугирования используют двухсекторные полосовые
сердечники типа I (рис. 1), и опыты проводят в двухлучевом режиме.
Низкомолекулярное вещество, создающее градиент плотности, обязательно
присутствует в обоих секторах.
Регистрация седиментации активного фермента. Регистрация седиментации
активного фермента осуществляется разными способами в зависимости от тех
изменений в растворе, которые влечет за собой реакция.
Случай 1: в результате реакции оптическая плотность среды
уменьшается. Примером может служить восстановление пирувата
лактатдегидрогеназой с одновременным окислением НАДН. Как пируват, так и
НАДН вводят лишь в тот сектор, в котором будет
177
седиментировать лактатдегидрогеназа (сектор А). Поэтому на длине волны
поглощения НАДН (максимум при 340 нм) начальная оптическая плотность
будет определяться исходной концентрацией НАДН (ез4о1нМ1см = 6,22). По
мере продвижения фермента оптическая плотность понижается и
последовательное сканирование дает между областью, где НАДН уже окислен
до НАД+, и областью с исходным НАДН систему границ (рис. 2А). Каждая
граница соответствует положению зоны с ферментом в момент сканирования.
